Nejčastější dotazy k buněčným kulturám: Kontaminace bakteriálním endotoxinem

Co je to endotoxin?

Endotoxiny jsou malé hydrofobní molekuly lipopolysacharidu (LPS) pocházející z bakterií, které mohou snadno kontaminovat laboratorní nádobí a jejichž přítomnost může významně ovlivnit jak in vitro tak in vivo experimenty. Jejich přítomnost se zjišťuje pomocí limulus amebocytárního lyzátu (test LAL), který dokáže detekovat až 0,01 endotoxinových jednotek (EU)/ml. Endotoxiny mají velikost přibližně 10 kDa, ale snadno vytvářejí velké agregáty o velikosti až 1 000 kDa. Bakterie vylučují endotoxin ve velkém množství při buněčné smrti a při aktivním růstu a dělení. Jedna Escherichia coli obsahuje přibližně 2 miliony molekul LPS na buňku. Endotoxiny mají vysokou tepelnou stabilitu, což znemožňuje jejich zničení za běžných sterilizačních podmínek. Jsou to amfipatické molekuly, které v roztoku nesou čistý záporný náboj. Vzhledem ke své hydrofobnosti mají pravděpodobně silnou afinitu k jiným hydrofobním materiálům, jako jsou plastové výrobky používané v laboratoři. Z tohoto důvodu je běžná kontaminace přenosem z laboratorních kádinek, míchadel a dalšího laboratorního nádobí.

Figure 1. Structure and physical properties of bacterial endotoxin. Endotoxins are complex lipopolysaccharides (LPS) present in the outer cell membrane of gram-negative bacteria. Endotoxins consist of a core polysaccharide chain, O-specific polysaccharide side chains (O-antigen) and a lipid component, Lipid A, which is responsible for the toxic effects.

Jaký je rozdíl mezi endotoxinem a exotoxinem?

Oboje je pro buněčné kultury potenciálně nebezpečné. Exotoxiny jsou toxické látky, obvykle proteiny, vylučované bakteriemi a uvolňované mimo buňku. Zatímco endotoxiny jsou bakteriální toxiny sestávající z lipidů, které se nacházejí v buněčné stěně bakterie. Exotoxiny se obvykle ničí teplem, zatímco endotoxiny nelze zničit vysokou teplotou. Exotoxiny mají vysokou antigenicitu a vyvolávají imunitní reakci, zatímco endotoxiny ne.

Jak se testuje endotoxin?

Test na přítomnost endotoxinu v limulus amebocytárním lyzátu (LAL test) je nejčastěji používaným testem. LAL (získaný z kraba podkovovitého) reaguje s bakteriálním endotoxinem lipopolysacharidem (LPS), který je membránovou složkou gramnegativních bakterií, za vzniku gelové sraženiny, kterou lze kvantifikovat. Endotoxin se měří v endotoxinových jednotkách na mililitr (EU/ml). Jedna EU odpovídá přibližně 0,1 až 0,2 ng endotoxinu/ml roztoku. V současné době existují tři formy testu LAL, každá s různou citlivostí. Gelový test na sraženiny LAL dokáže detekovat až 0,03 EU/ml, zatímco kinetický turbidimetrický a chromogenní test LAL dokáže detekovat až 0,01 EU/ml.

Figure 2. LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.

Jaké jsou běžné zdroje kontaminace endotoxiny v laboratoři?

Důkladná čistota veškerého laboratorního nádobí, surovin pro média a správné laboratorní techniky jsou nezbytné pro podstatné snížení hladiny endotoxinů v laboratoři buněčných kultur. Doporučuje se také sterilizovat všechna média pomocí filtračního zařízení, jako je Filtrační jednotka Stericup^® která dokáže eliminovat všechny potenciální endotoxiny před zavedením do buněk.

• Voda: Vysoce čistá voda je pro každou laboratoř nezbytná. Milli-Q^® Integral je systém čištění vody poskytující laboratořím ultračistou vodu bez endotoxinů, a to přímo z vody z vodovodu. Systém má kapacitu až 300 l/den čisté a/nebo ultračisté vody, což uspokojí potřeby většiny laboratoří. Kromě toho nabízíme jednorázové lahve vody bez endotoxinů pro všechny aplikace buněčných kultur.
• Sérum: Vzhledem ke svému biologickému živočišnému původu je fetální hovězí sérum jako historicky hlavní viník, který v sobě skrývá endotoxin. Zlepšený screening však tato rizika výrazně snížil. Každá šarže našeho séra byla testována na obsah endotoxinu, aby byla zajištěna vysoká úroveň účinnosti.
• Reagencie pro buněčné kultury: Běžná činidla jako Ecoli. odvozené rekombinantní růstové faktory, hormony, lipidy, základní média a disociační činidla jako trypsin mohou být zdrojem endotoxinu. Všechna naše testovaná činidla pro buněčné kultury testujeme na obsah endotoxinu.
• Plastové nádobí/sklo: Skleněné nádobí, plastové hadičky a příslušenství by neměly obsahovat pyrogen a opakovaně použitelné materiály by měly být oplachovány vodou bez pyrogenu nebo s nízkým obsahem endotoxinu. Plastové láhve by měly být sterilizovány ozařováním gama zářením.
• Kontaminace uživatele: Bakterie jsou přítomny na všech površích kůže, vlasů a slin. Proto je při manipulaci s buněčnými kulturami nutná správná aseptická technika, aby se minimalizovalo riziko vnesení endotoxinu do systému.

Jaké jsou účinky endotoxinu na buněčné kultury?

Endotoxiny ovlivňují jak in vitro tak in vivo růst a funkci buněk a jsou zdrojem značné variability. In vitro existuje stále více důkazů, že endotoxiny způsobují řadu problémů při výzkumu buněčných kultur. Mezi zdokumentované účinky patří stimulace leukocytárních kultur k produkci tkáňových faktorů, indukovaná produkce IL-6 u koňských makrofágů a inhibice tvorby myších erytroidních kolonií velmi nízkými hladinami (méně než 1 ng/ml) endotoxinu. In vivo vyvolávají endotoxiny ve studiích na zvířatech zánětlivou reakci. Přítomnost endotoxinu v injekčních přípravcích (vakcínách a injekčně podávaných lécích) může vést k pyrogenní reakci od horečky a zimnice až po nevratný a smrtelný septický šok.

Jaké jsou přípustné limity endotoxinu v buněčných kulturách?

Vzhledem k závažným rizikům spojeným s kontaminací endotoxinem stanovil americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) limity koncentrace endotoxinu pro zdravotnické prostředky a parenterální léčiva, které by měli vědci znát. Současné limity FDA vyžadují, aby eluáty ze zdravotnických prostředků byly nižší než 0,5 EU/ml, pokud prostředek nepřijde do styku s mozkomíšním mokem, kde je pak limit 0,06 EU/ml.

Jak zabráníte kontaminaci endotoxiny?

Je nezbytné používat reagencie, doplňky a média testované na endotoxin od důvěryhodného dodavatele reagencií. Důležité je také používat správné aseptické techniky a před kultivací buněk důkladně opláchnout a sterilizovat veškeré plastové nádobí a spotřební materiál, jako jsou pipety a kónické zkumavky.

Jak odstranit endotoxin v případě kontaminace kultur?

Pokud jsou kultury kontaminovány endotoxinem, doporučuje se zlikvidovat všechna činidla a buňky a začít s novými činidly a buňkami. Pokud však vzorek nelze zlikvidovat, lze k jejich odstranění použít činidla. Tyto roztoky pro odstranění endotoxinů se při odstraňování endotoxinů LPS ze vzorků spoléhají na micelární vlastnosti Tritonu X-114.

Materiály

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch