Základy polymerázové řetězové reakce (PCR)
Co je to PCR?
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je běžná technika molekulární biologie, která umožňuje výzkumníkům vytvořit několik kopií určité oblasti DNA. PCR je účinná, rychlá a dokáže amplifikovat sekvence DNA nebo RNA z různých zdrojů. Po dostatečné amplifikaci DNA lze výsledný produkt sekvenovat, analyzovat pomocí gelové elektroforézy nebo klonovat do plazmidu pro experimentální účely.
Jak PCR funguje? Jaké jsou kroky PCR?
Jednoduchá reakce PCR se skládá z cílové DNA, sady syntetických oligonukleotidových primerů, které lemují cílovou sekvenci DNA, termostabilní polymerázy DNA (obvykle Taq polymerázy) a nukleotidů. Tři kroky každého amplifikačního cyklu zahrnují denaturaci, žíhání a prodlužování.
- Nejprve se DNA denaturuje zahřátím na 90-95 ˚C, čímž se dvouřetězcová DNA (dsDNA) rozdělí na jednořetězcovou. Teplota, při které je denaturováno 50 % dsDNA, se nazývá teplota tání (Tm) a je určena obsahem G+C, délkou vzorku a koncentrací iontů (především Mg2+).
- Při kroku žíhání se vzorek ochladí na 40-60 ˚C, což umožní primerům navázat se na cílovou DNA.
- Konečný krok PCR probíhá při 70-75 ˚C a nazývá se extenze. Během této fáze DNA polymeráza prodlužuje DNA z primerů a vytváří novou dsDNA s jedním starým a jedním novým vláknem.
Co jsou primery PCR?
Primery jsou jednotlivá vlákna nukleových kyselin (syntetické oligonukleotidy), která jsou nezbytná pro zahájení PCR. Tato jednotlivá vlákna DNA nebo RNA jsou specifická a komplementární k cílové části sekvence DNA/RNA. Během ochlazovací (annealing) fáze PCR se primer naváže na cílovou část a zahájí kopírování cílové sekvence DNA/RNA. Primery se používají v párech, známých jako přední a reverzní primery. Nabízíme vlastní oligos v několika formátech.
Sekvence primerů musí být vybrány tak, aby cílily na jedinečnou oblast DNA, čímž se zabrání možnosti hybridizace s podobnou sekvencí. Při navrhování primerů by páry měly mít podobné teploty tání, protože krok žíhání probíhá pro obě vlákna současně. Kromě toho by primer s Tm (teplotou tání) příliš vyšší než teplota žíhání reakce mohl hybridizovat a prodloužit se na nežádoucí sekvenci DNA. A Tm mnohem nižší než teplota žíhání by mohla vést k neúspěšnému žíhání.
Kolik kopií DNA vytváří PCR?
Protože vlákna syntetizovaná v jednom cyklu PCR slouží jako templát v dalším cyklu, je dosaženo milionnásobného nárůstu množství DNA během pouhých 20 cyklů. Tyto cykly lze provádět automaticky pomocí přístroje s termálním cyklérem.1,2,3
Populární produkty PCR
Rutinní PCR se používá k vytvoření amplifikovaného množství DNA pro následné aplikace, včetně ověření délky klonu. Naše produkty nabízejí řadu možností pro provádění rutinní PCR. Naše reakční směsi ReadyMix™ PCR a možnosti barviv REDTaq® poskytují dodatečné pohodlí pro vaši amplifikační reakci.
- Taq DNA polymerázy
- Reakční směsi pro PCR
- Roche AptaTaq Fast Start DNA Polymerase
- Roche Expand™
- Roche FastStart™ Taq
Taq DNA polymerázy
Taq& DNA polymeráza je specializovaný termostabilní enzym izolovaný z Thermus aquaticus, termofilní bakterie. Taq je nejčastěji používanou DNA polymerázou pro PCR a nyní je rekombinantně exprimována v E. coli. Enzym je schopen 5′ → 3′ polymerázové a exonukleázové aktivity; při vyšetření SDS-PAGE nebylo zjištěno žádné zjistitelné znečištění spojené s endonukleázami nebo exonukleázami.
REDTaq® DNA polymerázy
REDTaq® DNA polymeráza je naše jedinečná směs Taq DNA polymerázy s inertním červeným barvivem. Tato směs funguje stejně dobře jako čirá Taq enzymová směs a neinterferuje s navazujícími aplikacemi. Její primární funkcí je identifikace - roztoky lze snadno sledovat ve zkumavkách PCR a gelech. V případě potřeby lze barvivo po amplifikaci odstranit standardními purifikačními metodami.
Obrázek 1.Výtěžnost DNA polymerázy REDTaq® ve srovnání se standardní Taq za stejných podmínek.
Obrázek 2.Barvivo REDTaq® migruje jako fragment 125 bp, takže není třeba používat zaváděcí pufry a sledovací barviva.
Reakční směsi pro PCR
Připravené směsi ReadyMix™. PCR reakční směsi obsahují naši vysoce kvalitní Taq DNA polymerázu, 99 % čistých dNTP a pufr ve 2X optimalizovaném reakčním koncentrátu. Tento pohodlný produkt snižuje počet pipetování a minimalizuje riziko kontaminace tím, že eliminuje různé kroky míchání. Stačí přidat templát a primery do reakční směsi ReadyMix™. Reakční směsi PCR jsou sestaveny tak, aby vyhovovaly různým potřebám PCR, a pro větší pohodlí je lze zakoupit v kombinaci s barvivem REDTaq® Dye.
Obrázek 3.Amplifikace 1, 2, 3 a 7 kb fragmentů a 4,5 kb lidské genomové DNA pomocí ReadyMix™ Taq PCR Reaction Mix.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?