Capto MMC

Capto MMC je multimodální kationtový výměník s vlastnostmi slabého kationtového výměníku. Kromě elektrostatických interakcí poskytuje struktura ligandu další interakční módy, jako jsou hydrofobní interakce, vodíková vazba a thiofilní interakce (obrázek 3.8). Různé možné způsoby interakce poskytují médiu novou selektivitu a činí ho tolerantním vůči solím, což zase umožňuje načítat vzorek bez ředění nebo kroku výměny pufru, což vede ke zvýšení produktivity.

Obrázek 3.8. Capto MMC ligand. Interakce jsou znázorněny šipkami: (A) pro thiofilní; (B) pro hydrofobní; (C) pro vodíkovou vazbu a (D) pro elektrostatické interakce.

Capto MMC je založeno na vysoce tuhé agarosové základní matrici, která umožňuje vysoké průtoky a nízký protitlak ve velkém měřítku a je vhodná pro rychlé, účinné a nákladově efektivní čištění proteinů. Viz také obrázek 3.1 (Multimodální chromatografická média) a k němu připojená diskuse o vlastnostech tlaku a toku.

Capto MMC poskytuje vyšší produktivitu a nižší náklady díky:

• vysokou DBC i při vysoké vodivosti (vazbu proteinů lze provádět při vodivosti vstupního materiálu)
• vysokou objemovou propustnost
• novou selektivitu
• menší provoz jednotek (není nutné ředění vstupního materiálu, což vede k menším nádržím a rychlejšímu provozu)

Vysoká tolerance vůči solím

Různé interakce média Capto MMC popsané výše poskytují vlastnosti odlišné od tradičních kationtových výměníků, včetně vazby proteinů při vysoké koncentraci solí (obrázek 3.9). Capto MMC lze proto použít k přímému zatížení výchozích materiálů bez předchozího ředění nebo výměny pufru za účelem snížení vodivosti výchozího materiálu.

Obrázek 3.9. (A) DBC Capto MMC při době setrvání 1 min pro tři různé proteiny s různou vodivostí. (B) Capto MMC umožňuje mnohem větší pracovní rozsah z hlediska vodivosti výchozího materiálu než tradiční kationtové výměníky.

Jedinečná selektivita

Jedinečnou selektivitu lze využít i k řešení specifických problémů s čištěním při vysoké nebo nízké vodivosti. Srovnání tradičního kationtového výměníku (SP Sepharose Fast Flow) a Capto MMC ukazuje, že selektivita obou médií se výrazně liší (obrázek 3.10). Eluční profil na SP Sepharose Fast Flow odhalil jeden pík, zatímco eluční profil na Capto MMC vykazuje dva, případně tři píky. Nativní gelová elektroforéza rovněž ukázala, že separační vzorce se mezi médii liší.

Obrázek 3.10. Selektivita (A) Capto MMC a (B) SP Sepharose Fast Flow byla zkoumána pomocí lidské krevní plazmy, jak je popsáno výše. Frakce (označené šipkami) a průtočný pool (FT) byly analyzovány na nativním gradientu PhastGel™ 8-25 % a obarveny Coomassie™. Na gely byl také nanesen vysokomolekulární marker (HMW, Cytiva) a nefrakcionovaný vzorek plazmy.

Na rozdíl od tradičních kationtových výměníků může Capto MMC vázat proteiny nad pI cílového proteinu (obrázek 2.5 v kapitole 2, Vazba/vylučování vs. flowthrough mód v multimodální chromatografii). Pokud se tedy pro eluci používá pH, je u Capto MMC nutné vyšší pH než u tradičních kationtových výměníků. To ilustruje screeningová studie eluce uvedená na obrázku 3.11.

Obrázek porovnává výsledky získané na destičkách PreDictor s výsledky získanými v kolonách. Nejlepší výtěžnosti v elučním kroku je dosaženo při současné změně pH a koncentrace soli. V obou formátech nejsou získány identické výsledky, ale trendy i nalezené optimální podmínky jsou stejné.

Nejlepší výtěžnost je dosažena při pH 6,75, což je přibližně o 2 jednotky pH vyšší než pI BSA. Další podrobnosti viz aplikační poznámka 28-9277-90, "Vysokokapacitní screening elučních podmínek na Capto MMC pomocí destiček PreDictor"

.

Obrázek 3.11. Obrysové grafy pro výtěžnost BSA v procentech (viz popisky v každém obrysovém grafu) v (A) destičkách PreDictor a (B) sloupci Tricorn. Výtěžnost je vynesena jako funkce koncentrace soli (osa y) a iontové síly pufru (BIS; osa x, probíhá od 0,05 do 0,30 M) při třech různých hodnotách pH pro dva typy solí NH4Cl a NaCl. Zatížení bylo 70 % DBC při 10% průrazu a zatěžovací pufr byl 50 mM octan sodný, pH 4,75, 250 mM NaCl. Experimentální datové body jsou zobrazeny jako černé tečky.

Typ soli a aditiva

Jak již bylo uvedeno (kapitola 2, Typy soli a aditiva), volba typu soli nebo použití aditiv ovlivní chromatografické chování multimodálních médií. Například výtěžnost cílové molekuly je ovlivněna použitým typem soli, jak je ukázáno na obrázku 3.11. Vliv různých aditiv na DBC na Capto MMC je znázorněn na obrázku 3.12. V tomto příkladu neměly detergenty a protipěnidla významný vliv na kapacitu, zatímco organická rozpouštědla a látky narušující vodíkové vazby měly větší vliv.

Obrázek 3.12. Vliv přísad na DBC BSA na Capto MMC. DBC je vynesena jako procento referenčního běhu v nepřítomnosti aditiv. BHT = butylovaný hydroxytoluen.

Vázací kapacitu a výtěžnost mohou ovlivňovat také různé přísady. Vliv močoviny a organických rozpouštědel, ethanolu a isopropylalkoholu na DBC je znázorněn na obrázku 3.12. Snížená kapacita v přítomnosti močoviny a organických modifikátorů naznačuje, že je lze použít ke zlepšení účinnosti eluce.

Regenerace

O údržbě média, včetně CIP a skladování, viz Příloha 2 (Údržba média a podmínky skladování).