Odsolování a výměna pufrů pro afinitní chromatografii protilátek

Všeobecné úvahy

Odsolování v laboratorním měřítku je osvědčená, jednoduchá a rychlá metoda, která rychle odstraní nízkomolekulární kontaminanty a zároveň v jednom kroku převede vzorek do požadovaného pufru.

Cytiva nabízí řadu předbalených chromatografických kolon a 96jamkových filtračních destiček, které lze používat ručně, společně s chromatografickým systémem nebo ve vysoce výkonných aplikacích (tabulka 2.8). Tyto produkty obsahují Sephadex™ G-25, velikostně vylučovací chromatografické médium (SEC, známé také jako gelová filtrace), které umožňuje účinné odstranění nízkomolekulárních látek z protilátek s molekulovou hmotností > 5000.

V případě potřeby použijte odsolování/výměnu pufru před a/nebo mezi purifikačními kroky. Nezapomeňte, že každý krok navíc může snížit výtěžnost a že odsolování často ředí vzorek (centrifugační protokoly vzorky neředí).

Odstraňte soli a další nízkomolekulární látky z proteinů s molekulovou hmotností > 5000.

Tabulka 2.8. Průvodce výběrem odsolovací kolony/kolony pro výměnu pufru

Sloupce a 96jamkové destičky	Střední	.Naložený objem (ml)	Elutovaný objem (ml)	Ředicí faktor	Operace
HiTrap®Odsolování	Sephadex™ G-25 Superfine	0.25	1,0	4	Systém stříkačky/čerpadla/chromatografie
		0.5	1,5	3	Stříkačka/čerpadlo/chromatografický systém
		1.0	2,0	2	Syringe/čerpadlo/chromatografický systém
		1.5 (max.)	2,0	1.3	Stříkačka/čerpadlo/chromatografický systém
2× HiTrap<.sup>® odsolování	Sephadex™ G-25 Superfine	3.0 (max.)	4,0 až 5,0	1,3 až 1.7	Systém stříkačka/čerpadlo/chromatografický systém
3× HiTrap	Sephadex™ G-25 Superfine	4.5 (max.)	6,0 až 7,0	1,3 až 1.7	Systém stříkačka/čerpadlo/chromatografický systém
HiPrep™ 26/10 Odsolování.	Sephadex™ G-25 Fine	10	10 až 15	1.0 až 1.5	Čerpadlo/chromatografický systém
		15 (max.)	15 až 20	1,0 až 1.3	Čerpadlo/chromatografický systém
2x HiPrep™ 26/10 Odsolování	Sephadex™ G-25 Fine	30 (max.)	30 až 40	1,0 až 1.3	Čerpadlo/chromatografický systém
3x HiPrep™ 26/10 Desalting	Sephadex™ G-25 Fine	45 (max.)	45 až 55	1.0 až 1,2	Čerpadlo/chromatografický systém
4x HiPrep™ 26/10 Odsolování	Sephadex™ G-25 Fine	60 (max.)	60 až 70	1,0 až 1.2	Čerpadlo/chromatografický systém
PD SpinTrap™ G-25	Sephadex™ G-25 Medium	0.1 až 0,18	0.1 až 0,18	Žádné ředění	Centrifuga
PD MultiTrap™ G-25	Sephadex™ G-25 Medium	0.07 až 0,13	0,07 až 0.13	Žádné ředění	Centrifuga
PD MiniTrap™ G-25	Sephadex™ G-25 Medium	0.2 až 0,5 0,1 až 0,5	0,1 až 0,5 1.0	Žádné ředění 2	Centrifuga Gravitační fl.ow
PD MidiTrap™ G-25	Sephadex™ G-25 Medium	0.5 až 1,0 0,1 až 0,5	0,5 až 1,0 1,5	Neředí se 1.5	Centrifugační Gravitační flow
Odsolovací kolony PD-10	Prostředí Sephadex™ G-25	1.0 až 2,5 0.1 až 0,5	1,0 až 2,5 3,5	Žádné ředění 1 až 1.5	Centrifuga Gravitační flow

Zpracovat lze až 30 % celkového objemu odsolovací kolony. Vysoká rychlost a kapacita separace umožňuje rychlé a efektivní zpracování i relativně velkých objemů vzorků v laboratoři. Koncentrace vzorku neovlivňuje separaci, pokud koncentrace protilátek nepřekročí přibližně 70 mg/ml při použití běžných vodných pufrů a za předpokladu, že protilátka je při použité koncentraci stabilní a rozpustná.

Pokud je odsolování prvním krokem chromatografie, měl by se vzorek nejprve vyčistit; doporučuje se odstředění a/nebo filtrace.

Použije se 100 mM octan amonný nebo 100 mM hydrogenuhličitan amonný, pokud jsou vyžadovány těkavé pufry.

Desaltace poskytuje několik výhod oproti dialýze, která je obecně pomalou technikou vyžadující velké objemy pufru a nese s sebou riziko ztráty materiálu při manipulaci.

V laboratorním měřítku lze vynechat krok výměny pufru a odsolování, pokud jsou vzorky po filtraci nebo centrifugaci dostatečně čisté. V případě AC nebo IEX může být dostačující úprava pH vzorku a případně iontové síly vzorku.

Výměně pufru se lze někdy vyhnout ředěním za účelem snížení iontové síly, přidáním síranu amonného před HIC nebo titrací za účelem úpravy pH.

Odsolování vzorků v malém měřítku

Pro objemy vzorků od 0.2 ml až 2,5 ml je možné provádět paralelní odsolování více vzorků pomocí odsolovacích kolon PD-10, PD MidiTrap™ G-25 a gravitačních kolon PD MiniTrap™ G-25. V případě potřeby je možné provést odsolení více vzorků. Pro tyto gravitační kolony jsou k dispozici dva různé protokoly: jeden pro manuální použití na laboratorním stole a druhý pro použití společně se standardní odstředivkou v kombinaci s adaptérem Spin Adapter.

Pro menší objemy vzorků v rozmezí 100 až 180 µl lze na spinových kolonách PD SpinTrap™ G-25 společně s mikrocentrifugou nebo 96jamkovou destičkou PD MultiTrap™ G-25 použít k extrakci více vzorků pomocí centrifugace (obrázek 2.2).

Obrázek 2.2. (A) Příprava vzorku PD SpinTrap™ G-25. (B) Automatizovaná příprava vzorku PD MultiTrap™ G-25 v robotickém systému. (C a D) Spinové adaptéry se používají společně s odsolovacími kolonami PD-10, PD MidiTrap™ G-25 a PD MiniTrap™ G-25 ve standardní centrifuze.

Odstraňování větších objemů vzorků pomocí kolonek HiTrap^® a HiPrep™

.Zapojením až tří odsolovacích kolonek HiTrap^® do série zvýšíte kapacitu objemu vzorku, například dvě kolonky umožňují odebrat vzorek o objemu 3 ml, tři kolonky umožňují odebrat vzorek o objemu 4 ml.5 ml (tabulka 2.8).

Zapojením až čtyř HiPrep™ 26/10 Desalting kolon do série zvýšíte kapacitu objemu vzorku, například dvě kolony umožňují objem vzorku 30 ml; čtyři kolony umožňují objem vzorku 60 ml. I se čtyřmi kolonami v sérii lze vzorek zpracovat za 20 až 30 minut (Tabulka 2.8).

Příprava pufru

Pro látky nesoucí nabité skupiny se doporučuje eluent obsahující pufrovací sůl. Doporučuje se koncentrace soli nejméně 150 mM, aby se zabránilo možným iontovým interakcím s médiem. K tomuto účelu se často používá chlorid sodný. Často postačí pufr o koncentraci 25 až 50 mM pufrovací látky.

Při koncentraci soli nad 1 M může dojít k retardaci hydrofobních látek nebo k jejich vazbě na médium. Při ještě vyšších koncentracích solí (> 1,5 M síranu amonného) se obal kolony smršťuje.

Příprava vzorku

Koncentrace vzorku nemá na separaci vliv, pokud se viskozita neliší od viskozity použitého pufru více než 1,5krát. To odpovídá maximální koncentraci 70 mg/ml pro proteiny při použití běžných vodných pufrů.

Vzorek by měl být plně rozpustný. Bezprostředně před načtením pufru jej odstřeďte nebo použijte filtr (0,45 µM filtr), abyste v případě potřeby odstranili pevné částice.

Rozpustnost proteinů často závisí na pH a/nebo iontové síle (koncentraci soli), a výměna pufru proto může vést k vysrážení proteinu. Také může dojít ke ztrátě aktivity proteinu, pokud se změna pH dostane mimo rozsah, ve kterém je protein aktivní.

Protokoly v následujících částech popisují odsolování a výměnu pufru pomocí různých formátů předbalených kolon.

Ruční odsolování pomocí kolon HiTrap^®

Obrázek 2.3. Odsolovací kolona HiTrap® umožňuje efektivní a snadno proveditelné skupinové separace pomocí stříkačky, čerpadla nebo chromatografického systému.

HiTrap^® Desalting je 5ml kolona (obrázek 2.3) naplněná osvědčeným médiem SEC, Sephadex™ G-25 Superfine. Médium je založeno na zesíťovaných dextranových kuličkách, které umožňují vynikající rozlišení a vysokou rychlost flow. Rozsah frakcionace pro globulární proteiny se pohybuje mezi M_r 1 000 a 5 000, s vylučovací mezí přibližně M_r 5 000. V případě, že se jedná o globulární proteiny, je možné použít médium pro frakcionaci s M_r 5 000. Tím je zajištěno skupinové oddělení proteinů/peptidů větších než M_r 5 000 od molekul s molekulovou hmotností menší než M_r 1 000. V případě, že se jedná o molekuly s molekulovou hmotností menší než M_r 1 000, je možné je oddělit.

HiTrap^® Desalting lze použít s vodnými roztoky v rozmezí pH 2 až 13. V případě, že se jedná o roztoky s vysokým pH, je možné použít i roztoky s vysokým pH. Předbalené médium je stabilní ve všech běžně používaných pufrech, roztocích močoviny (8 M), guanidin-hydrochloridu (6 M) a všech neiontových a iontových detergentech. V pufru nebo ve vzorku lze použít nižší alkoholy (methanol, ethanol, propanol), ale doporučujeme udržovat koncentraci pod 25 % v/v. Je třeba se vyhnout dlouhodobému působení (hodiny) pH nižšímu než 2 nebo vyššímu než 13 nebo oxidačním činidlům.

Doporučený rozsah objemů vzorků je 0,1 až 1,5 ml, pokud je požadováno úplné odstranění nízkomolekulárních složek. Separace není ovlivněna rychlostí flow v rozmezí 1 až 10 ml/min. Maximální doporučená rychlost flow je 15 ml/min. Separace se snadno provádí pomocí injekční stříkačky, čerpadla nebo chromatografického systému. Až tři kolony lze zapojit do série, což umožňuje zpracovávat větší objemy vzorků.

Obrázek 2.4 ukazuje typickou separaci při odsolování a výměně pufru, které bylo dosaženo pomocí HiTrap^® Desaltingu a která byla sledována pomocí změn UV absorpce a vodivosti.

Obrázek 2.4. Vysoce efektivní odsolení za 30 s pomocí HiTrap® Desalting.

Abyste zabránili křížové kontaminaci, používejte kolonu pouze se stejným typem vzorku.

Ekvilibrace kolony

1. Naplňte stříkačku nebo hadičku pumpy pufrem. Odstraňte zátku. Abyste zabránili vniknutí vzduchu do kolony, připojte kolonu "po kapkách" buď ke stříkačce (pomocí konektoru), nebo k hadičce pumpy.
2. Odstraňte zacvakávací koncovku na výstupu z kolony.
3. Promyjte kolonu 25 ml pufru rychlostí 5 ml/min, abyste zcela odstranili zásobní pufr, který obsahuje 20 % ethanolu*. Pokud je v koloně zachycen vzduch, promývejte ji odplyněným pufrem, dokud vzduch nezmizí. Vzduch vnesený do kolony náhodně při aplikaci vzorku nemá na separaci influentní vliv.

* 5 ml/min odpovídá přibližně 120 kapkám/min při použití kolony HiTrap^® 5 ml.

Ruční odsolování pomocí injekční stříkačky

1. Chcete-li provozovat kolonu pomocí injekční stříkačky, připojte stříkačku ke koloně pomocí dodaného konektoru.
2. Ekvilibrace kolony, viz předchozí strana Ekvilibrace kolony.
3. Naneste vzorek pomocí stříkačky o objemu 2 až 5 ml při rychlosti průtoku fl mezi 1 a 10 ml/min. Kapalinu eluovanou z kolony zlikvidujte. Pokud je objem vzorku menší než 1,5 ml, přejděte na pufr a pokračujte v nástřiku, dokud nebude eluováno celkem 1,5 ml. Elutovanou kapalinu zlikvidujte.
4. Elultujte protein příslušným objemem vybraným z tabulky 2.9. Odsolený protein shromážděte.

Maximální doporučený objem vzorku při použití jedné kolony HiTrap^® Desalting 5 ml je 1,5 ml, tabulka 2.9. , Tabulka 2.8 pro informace o použití menších objemů vzorků.

Tabulka 2.9. Doporučené objemy vzorku a eluční objemy při použití HiTrap® Desalting s injekční stříkačkou, s příklady typických výtěžků a zbývající soli v odsoleném vzorku.

Zásobení vzorku (ml)	Přidání pufru (ml)	Elute a odběr (ml)	Výtěžek (%)	Zbytková sůl (%)	Ředicí faktor
0.25	1,25	1,0	> 95	0.0	4,0
0,50	1,0	1.5	> 95	< 0,1	3,0
1.00	0,5	2,0	> 95	< 0.2	2,0
1,50	0,0	2.0	> 95	< 0,2	1,3

Prázdný objem kolony je 1,5 ml. Vysokomolekulární složky eluují v rozmezí 1,5 až 4,5 ml v závislosti na objemu vzorku. Složky s nízkou molekulovou hmotností se začínají eluovat po 3,5 ml.

Některé typy molekul, jako jsou malé heterocyklické nebo homocyklické aromatické sloučeniny (puriny, pyrimidiny, barviva), mohou se Sephadexem™ interagovat, a proto se eluují později, než se očekává. V těchto případech lze použít větší objemy vzorků, ale separace musí být optimalizována pro každý typ kontaminující sloučeniny.

Desalinace pomocí čerpadla

1. Ekvilibrace kolony: viz Ekvilibrace kolony na předchozí straně.
2. Naneste až 1,5 ml vzorku. Monitorujte effluent z kolony pomocí UV monitoru a/nebo monitoru vodivosti. Udržujte rychlost fluktuace v rozmezí 1 až 10 ml/min. Sbírejte frakce.
3. Před nanesením dalšího vzorku se kolona zředí přibližně 10 ml pufru. Sbírejte frakce.

Automatické odsolování pomocí odsolovacích kolon HiTrap^® na přístroji ÄKTAprime plus

ÄKTAprime plus obsahuje předprogramované šablony pro jednotlivé kolonky HiTrap^® Desalting a HiPrep™ Desalting 26/10. V případě, že je to nutné, je možné je použít pro jednotlivé kolonky HiTrap^® Desalting. Níže uvedený postup používá kolonku HiTrap^® Desalting 5 ml.

Příprava pufru
Ekvilibrační pufr (port A1): Připravte si alespoň 500 ml požadovaného pufru

Voda a chemikálie použité pro přípravu pufru by měly být vysoce čisté. Před použitím přefiltrujte pufry přes filtr 0,45 µM.

Příprava vzorku

Propusťte vzorek přes filtr 0,45 µM.
Maximální doporučený objem vzorku je 1,45 µM.5 ml.

Příprava ÄKTAprime plus

1. Vložte vstupní hadičky z portu A (portový ventil) a portu B (2-portový ventil) do pufru.
2. Vložte tři hnědé odpadní hadičky do odpadní flasičky.
3. Připojte kolonu mezi port 1 na vstřikovacím ventilu (7portový ventil) a UV flow cell.
4. Naplňte stojan sběrače frakcí 18mm zkumavkami (minimálně 20) a umístěte bílou destičku na frakcionačním rameni proti první zkumavce.
5. Připojte dostatečně velkou smyčku pro vzorek mezi porty 2 a 6 na injekčním ventilu. Pomocí injekční stříkačky ručně filtrujte smyčku.
   
   Poznámka: Pokud je zapotřebí smyčka Superloop™, další informace jsou uvedeny v návodu k použití. zadejte objem vzorku a stisknutím OK spusťte šablonu.

Jakmile je systém připraven, zbývající kroky (v části Výběr aplikační šablony a spuštění metody níže) se provedou automaticky.

Výběr šablony aplikace a spuštění metody

1. Zkontrolujte komunikaci s PrimeView™. V pravém dolním rohu obrazovky by se měl zobrazit text Kontrolováno: Prime.
2. Použijte šipku a OK. se pohybujte ve stromu nabídek, dokud nenajdete položku Odsolování HiTrap^® Odsolování.

3. Zadejte objem vzorku a stisknutím OK spusťte šablonu.

Obrázek 2. Zadejte objem vzorku a stiskněte OK pro spuštění šablony.5 ukazuje typický výsledek odsolení globulárního proteinu normální velikosti pomocí odsolovací kolony HiTrap^® a chromatografického systému ÄKTAprime plus. Výsledek uvedený na tomto obrázku by se dal očekávat také při výměně protilátek v pufru. Stopy UV záření a vodivosti umožňují sloučení příslušných odsolených frakcí.

Obrázek 2.5. Typické odsolení globulárního proteinu normální velikosti pomocí chromatografického systému.

Skalování odsolování z HiTrap^® na HiPrep™

Pro separaci vzorků o objemu větším než 1.5 ml nebo pro zvýšení rozlišení mezi složkami s vysokou a nízkou molekulovou hmotností lze snadno sériově zapojit až tři odsolovací kolony HiTrap^® (Tabulka 2.8). Pro operace se stříkačkou je třeba úměrně zvýšit objemy navržené v tabulce 2.8 a zachovat doporučenou rychlost fluktuace. Ředění vzorku závisí na objemu vzorku a počtu kolon použitých v sérii. Lze dosáhnout nižších faktorů ředění, než jsou navrženy v tabulce 2.8 ale eluční objemy musí být optimalizovány pro každou kombinaci objemu vzorku a počtu kolon v sérii. Zpětný tlak pro každou kolonu je přibližně 0,25 baru při 10 ml/min.

HiPrep™ 26/10 Desalting je plněn přípravkem Sephadex™ G-25 Fine. Zajišťuje skupinovou separaci látek s vysokou (M_r > 5 000) od látek s nízkou molekulovou hmotností (M_r < 1 000) a umožňuje spolehlivé a reprodukovatelné odsolování a výměnu pufru při velikosti vzorku 15 ml na kolonu. Dvě až čtyři kolony lze použít v sérii (tabulka 2.8) pro objem vzorku 30 až 60 ml (obrázek 2.6).

Obrázek 2.6. Objem vzorku 60 ml lze použít na čtyřech sériově zapojených odsolovacích kolonách HiPrep™ 26/10.

Automatická výměna pufru na HiPrep™ 26/10 Odsolování pomocí ÄKTAprime plus

Příprava pufru
Ekvilibrační pufr (port A1): 20 mM fosforečnan sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 7.0. Připravte si alespoň 500 ml eluentu

Příprava vzorků

Voda a chemikálie použité pro přípravu pufru by měly být vysoce čisté. Před použitím přefiltrujte pufry přes filtr o průměru 0,45 µm.

Propusťte vzorek přes filtr o průměru 0,45 µm.

Maximální doporučený objem vzorku je 15 ml.

1. Vložte vstupní hadičky z portu A (8-portový ventil) a portu B (2-portový ventil) do pufru.
2. Vložte tři hnědé odpadní hadičky do odpadní flasičky.
3. Připojte kolonu mezi port 1 na vstřikovacím ventilu (7portový ventil) a UV flow cell.
4. Naplňte stojan sběrače frakcí 18mm zkumavkami (minimálně 25) a umístěte bílou destičku na frakcionačním rameni proti první zkumavce.
5. Připojte dostatečně velkou smyčku pro vzorek mezi port 2 a 6 na vstřikovacím ventilu. K ručnímu filtrování smyčky použijte injekční stříkačku.
   
   Poznámka: Pokud je zapotřebí smyčka Superloop, další informace jsou uvedeny v návodu k výrobku.

Po přípravě systému se zbývající kroky (v části Výběr aplikační šablony a spuštění dříve popsané metody) provedou automaticky.

Výběr Šablony aplikace a spuštění metody

1. Zkontrolujte komunikaci s PrimeView. V pravém dolním rohu obrazovky by se měl zobrazit text Kontrolováno: prime.
2. Pomocí tlačítek šipka a OK se pohybujte ve stromu nabídek, dokud se fikčně nezměníte.naleznete Dodstranění soli HiPrep™ odstranění soli.

3. Zadejte objem vzorku a stiskněte OK pro spuštění šablony.

Obrázek 2.7. Typické odsolování BSA pomocí chromatografického systému.

Odsolování v malém měřítku a výměna pufrů pomocí odsolovacích kolonek PD

Odsolovací kolonky PD-10, kolonky PD MidiTrap™ G-25, PD MiniTrap™ G-25, PD SpinTrap™ G-25 a PD MultiTrap™ G-25 a 96jamkové filtry.lterové destičky jsou předplněny médiem Sephadex™ G-25 pro skupinovou separaci vysokomolekulárních (M_r > 5 000) látek od nízkomolekulárních  (M_r < 1 000) odsolováním a výměnou pufru.

Produkty PD řeší potřebu flexibilní přípravy vzorku bílkovin nebo jiných biomolekul v malém měřítku před následnými analytickými technikami, jako je gelová elektroforéza, kapalinová chromatografie (LC), kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (LC-MS) a hmotnostní spektrometrie (MS). Tato kolekce kolon a destiček pokrývá rozsah objemů vzorků od 70 µl do 2,5 ml a podporuje paralelní zpracování více vzorků. Odsolovací kolony PD-10, PD MidiTrap™ G-25 a PD MiniTrap™ G-25 jsou také optimalizovány tak, aby umožňovaly odstřeďování, což vede k tomu, že nedochází k ředění eluovaného vzorku.

PD SpinTrap™ G-25

.

Obrázek 2.8. Kolony PD SpinTrap™ G-25 jsou jednorázové kolony pro rychlé odsolování a výměnu pufrů biomolekul s molekulovou hmotností > 5000.

PD SpinTrap™ G-25 je spinová kolona na jedno použití, která je navržena pro rychlé a vysoce reprodukovatelné odsolování a výměnu pufru 100 až 180 µl vzorku pomocí standardní mikrocentrifugy  (obrázky 2.2 A a 2.8). Kolony umožňují vysoce reprodukovatelné, paralelní odsolování/výměnu pufru a čištění proteinových vzorků bez ředění vzorku.

Každé balení PD SpinTrap™ G-25 obsahuje předbalené kolony a sběrné zkumavky pro 50 přípravků.

Pufr
Ekvilibrační pufr: Vhodný pro danou aplikaci

Postup při odsolování

1. Suspendujte médium vířením. Uvolněte šroubovací víčko a sejměte spodní uzávěr pomocí plastového nástroje pro sejmutí spodního uzávěru.
2. Uvolněte víčko a sejměte spodní uzávěr. Umístěte kolonu do sběrné zkumavky vhodné velikosti a odstraňte zásobní roztok odstředěním po dobu 1 min při 800 × g.
3. Odstraňte roztok z kolony. Ekvilibraci proveďte přidáním 400 µl ekvilibračního pufru a odstřeďujte 1 min při 800 × g. Zlikvidujte flowthrough a vyměňte sběrnou zkumavku. Tento postup zopakujte čtyřikrát.

Pro zajištění optimálních výsledků je velmi důležité ekvilibrovat spinovou kolonu celkem 1,5 ml ekvilibračního pufru, aby se zcela odstranil zásobní roztok.

4. Vyměňte použitou sběrnou zkumavku za novou čistou sběrnou zkumavku pro odběr vzorku.
5. Vyměňte použitou sběrnou zkumavku za novou čistou sběrnou zkumavku pro odběr vzorku. Pomalu naneste 100 až 180 µl vzorku do středu předem zabalené kolony.
6. Vložte vzorek do sběrné kolony. Eluujte centrifugací při 800 x g po dobu 2 min.

Pro odsolení větších objemů vzorků použijte větší škálu čisticích produktů PD nebo kolonek HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8. Pro odsolení více vzorků použijte PD MultiTrap™ G-25.

Výtěžnost závisí na typu proteinu nebo jiné biomolekuly. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. U vzorků o objemu menším než 140 µl lze výtěžnost zlepšit přidáním 40 µl ekvilibračního pufru poté, co se vzorek zcela vstřebá do lůžka kolony.

PD MultiTrap™ G-25

Obrázek 2.9. 96jamkové destičky PD MultiTrap™ G-25 nabízejí rychlé a vysoce reprodukovatelné čištění biomolekul s molekulovou hmotností > 5000.

PD MultiTrap™ G-25 96jamkové destičky jsou navrženy pro vysoce výkonné odsolování, výměnu pufrů a čištění proteinů s vysokou reprodukovatelností jamka od jamky a destička od destičky (obrázek 2.9). Pomocí 96jamkových destiček lze pohodlně a reprodukovatelně paralelně zpracovávat více vzorků (obrázek 2.10). PD MultiTrap™ G-25 lze provozovat manuálně nebo v automatizovaném režimu s použitím robotického systému spolu s centrifugou pro odsolování nebo výměnu pufru vzorků o objemech od 70 do 130 µl.

Jímky jsou předbaleny médiem Sephadex™ G-25, médiem SEC, které umožňuje účinné odstranění nízkomolekulárních látek z biomolekul s molekulovou hmotností > 5000.

Každé balení PD MultiTrap™ G-25 obsahuje čtyři předbalené 96jamkové destičky, což umožňuje odsolení nebo výměnu pufru až 384 vzorků. Pohodlné sběrné destičky (five v balení) jsou k dispozici samostatně.

Obrázek 2.10. Odstraňování chloridu sodného z BSA na 96jamkové destičce PD MultiTrap™ G-25 vykazovalo vysoce reprodukovatelné výsledky. Průměrná odsolovací kapacita byla 93 % a odchylka mezi jednotlivými jamkami byla 1 % (relativní směrodatná odchylka).

Centrifugační protokol

Pufr
Ekvilibrační pufr: Vhodný pro danou aplikaci

Postup odsolování

1. Suspendujte médium jemným protřepáním destičky dnem vzhůru. Odstraňte horní a dolní těsnění a položte destičku na sběrnou desku.
2. Odstraňte zásobní roztok odstředěním po dobu 1 minuty při 800 × g.
3. Odstraňte roztok z média. Ekvilibraci proveďte přidáním 300 µl ekvilibračního pufru na jamku. Odstřeďujte 1 min při 800 × g. Zlikvidujte flowthrough a vyměňte sběrnou destičku. Tento postup zopakujte čtyřikrát.

Pro zajištění optimálních výsledků je velmi důležité každou jamku ekvilibrovat celkem 1,5 ml ekvilibračního pufru, aby se zcela odstranil zásobní roztok.

4. Vyměňte použitou sběrnou destičku za novou, čistou sběrnou destičku pro odběr vzorků.
5. Vyměňte použitou sběrnou destičku za novou, čistou sběrnou destičku pro odběr vzorků. Naneste 70 až 130 µl vzorku do středu předbalených jamek.
6. Zkontrolujte, zda je vzorek dostatečný. Eluujte centrifugací při 800 × g po dobu 2 min.

Pro odsolení větších objemů vzorků použijte čisticí produkty PD většího rozsahu nebo kolonky HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8.

Vylučování závisí na typu proteinu nebo jiné biomolekuly. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. U vzorků o objemu menším než 100 µl lze výtěžnost zlepšit přidáním 30 µl ekvilibračního pufru poté, co se vzorek zcela vstřebá do lůžka kolony.

PD MiniTrap™ G-25

Obrázek 2.11. PD MiniTrap™ G-25 je předbalená kolona pro čištění proteinů s molekulovou hmotností > 5000 v objemech vzorků do 500 µl.

PD MiniTrap™ G-25 je navržen pro pohodlné odsolování a výměnu pufru pro 100 až 500 µl proteinového vzorku (obrázek 2.11). Kolony jsou předplněny médiem Sephadex™ G-25, což je médium SEC, které umožňuje účinné odstranění nízkomolekulárních látek z proteinů s molekulovou hmotností > 5000. Tyto kolony představují vynikající alternativu ke kolonám PD SpinTrap™ G-25 z důvodu větší kapacity objemu vzorku.

Pro větší flexibilitu má produkt dva alternativní aplikační protokoly, a to buď pomocí gravitace, nebo odstřeďování. Gravitační protokol umožňuje jednoduché čištění více vzorků paralelně bez nutnosti použití purifikačního systému. Při použití centrifugačního protokolu se vzorky čistí ve standardní odstředivce s minimálním ředěním eluovaného vzorku.

Každé balení PD MiniTrap™ G-25 obsahuje 50 předbalených kolon a čtyři adaptéry, které jsou nutné při použití centrifugačního protokolu.

Gravitační protokol

Pufr

Ekvilibrační pufr: Vhodný pro danou aplikaci

Postup při odsolování

1. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony. Odstraňte spodní uzávěr.
2. Naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a nechte ekvilibrační pufr zcela proniknout do plného lože. Opakujte dvakrát a zlikvidujte flowthrough.

Pro zajištění optimálních výsledků je velmi důležité ekvilibrovat kolonu celkem 8 ml ekvilibračního pufru, aby se zcela odstranil zásobní roztok.

3. Přidejte do kolony 100 až 500 µl vzorku. U objemů vzorku nižších než 500 µl přidejte ekvilibrační pufr, abyste upravili objem na 500 µl poté, co se vzorek zcela dostane do zabaleného lože.
4. V případě, že se vzorek dostane do kolony, přidejte ekvilibrační pufr. Nechte vzorek a ekvilibrační pufr zcela vstoupit do plněné vrstvy. Zlikvidujte průtokový roztok.
5. Vložte do zásobníku a zkontrolujte, zda je roztok v pořádku. Umístěte zkumavku pro odběr vzorku pod kolonu a eluujte 1 ml pufru. Sbírejte odsolený vzorek.

Pro odsolení větších objemů vzorků použijte kolonky HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8.

Výtěžnost závisí na typu proteinu. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. Výtěžnost a odsolovací kapacita jsou vyšší při použití gravitačního flow ve srovnání s odstřeďováním.

Typický výsledek odsolení proteinu je uveden na obrázku 2.12. Ačkoli odsolený protein zobrazený na obrázku je BSA, podobný výsledek by se dal očekávat při odsolování protilátek pomocí PD MiniTrap™ G-25.

Obrázek 2.12. Odstranění chloridu sodného z BSA pomocí gravitačního protokolu. Výtěžnost bílkovin byla 95 %.

Centrifugační protokol

Pufr
Ekvilibrační pufr: Vhodný pro danou aplikaci

Postup při odsolování

1. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony
2. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony. Pomocí kleští odstraňte horní filtr. Odstraňte spodní víčko.
3. Umístěte past PD MiniTrap™ G-25 do 15ml sběrné zkumavky a připojte dodaný adaptér kolony k horní části zkumavky.
4. Vložte do zkumavky s 15ml sběrným filtrem. Naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a nechte ekvilibrační pufr zcela proniknout do plného lože. Zopakujte a zlikvidujte průsakovou vodu.
5. Zkontrolujte, zda je kolona v pořádku. Znovu naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a odstřeďujte při 1000 x g po dobu 2 min a flowthrough vyhoďte.

Pro zajištění optimálních výsledků je velmi důležité ekvilibrovat kolonu celkem 8 ml ekvilibračního pufru (kroky 4 a 5), aby se zcela odstranil zásobní roztok.

6. Znovu naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a odstřeďujte při 1000 x g po dobu 2 min a flowthrough vyhoďte. Pomalu přidejte 200 až 500 µl vzorku do středu zabaleného lůžka.
7. Vložte vzorek do kolony. Umístěte nástrahu PD MiniTrap™ G-25 do nové 15ml sběrné zkumavky.
8. Vložte nástrahu PD MiniTrap™ G-25 do nové 15ml sběrné zkumavky. Eluujte centrifugací 1000 x g po dobu 2 min a sbírejte eluát.

Pro odsolení větších objemů vzorku použijte kolonky HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8.

Vyhledávání závisí na typu proteinu. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. Výtěžnost a odsolovací kapacita jsou vyšší při použití gravitačního flow ve srovnání s odstřeďováním.

PD MidiTrap™ G-25

.

Obrázek 2.13. PD MidiTrap™ G-25 je předbalená kolona pro čištění proteinů s molekulovou hmotností > 5000 v objemech vzorků do 1 ml.

PD MidiTrap™ G-25 je navržen pro pohodlné odsolování a výměnu pufru pro 0,5 až 1,0 ml proteinového vzorku (obrázek 2.13). Kolony jsou předplněny médiem Sephadex™ G-25, médiem SEC, které umožňuje účinné odstranění nízkomolekulárních látek z proteinů s molekulovou hmotností > 5000. Tyto kolony představují vynikající alternativu ke kolonám PD MiniTrap™ G-25 z důvodu větší kapacity objemu vzorku.

Pro větší flexibilitu má produkt dva alternativní aplikační protokoly, a to buď pomocí gravitace, nebo odstřeďování. Gravitační protokol umožňuje jednoduché čištění více vzorků paralelně bez nutnosti použití purifikačního systému. Při použití odstřeďovacího protokolu se vzorky čistí ve standardní odstředivce s minimálním ředěním eluovaného vzorku.

Každé balení PD MidiTrap™ G-25 obsahuje 50 předbalených kolon a čtyři adaptéry, které jsou nutné při použití odstřeďovacího protokolu.

Centrifugační protokol

Pufr
Ekvilibrační pufr: Vhodný pro danou aplikaci

Postup při odsolování

1. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony.
2. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony. Pomocí kleští odstraňte horní filtr. Odstraňte spodní víčko.
3. Umístěte past PD MidiTrap™ G-25 do 50ml sběrné zkumavky a připojte k horní části zkumavky dodaný adaptér kolony.
4. Vložte do zkumavky sběrný filtr. Naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a nechte ekvilibrační pufr zcela proniknout do naplněného lože. Zopakujte a zlikvidujte průsakovou vodu.
5. Zkontrolujte, zda je kolona v pořádku. Znovu naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a odstřeďujte při 1000 x g po dobu 2 min a flowthrough vyhoďte.

Pro zajištění optimálních výsledků je rozhodující ekvilibrovat kolonu celkem 15 ml ekvilibračního pufru (kroky 4 a 5), aby se zcela odstranil zásobní roztok.

6. Pomalu přidejte 0,75 až 1,0 ml vzorku do středu zabaleného lůžka.
7. Přidejte 0,75 až 1,0 ml vzorku. Umístěte nástrahu PD MidiTrap™ G-25 do nové 50ml sběrné zkumavky.
8. Vložte nástrahu PD MidiTrap™ G-25 do nové 50ml sběrné zkumavky. Eluujte centrifugací 1000 x g po dobu 2 min a sbírejte eluát.

Pro odsolení větších objemů vzorku použijte kolonky HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8.

Vyhledávání závisí na typu proteinu. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. Výtěžnost a odsolovací kapacita jsou vyšší při použití gravitačního flow ve srovnání s centrifugací.

Odsolovací kolony PD-10 na jedno použití

Odsolovací kolony PD-10 jsou určeny k pohodlnému odsolování a výměně pufru pro objem 1,0 až 2,5 ml proteinového vzorku. Kolony jsou předbaleny médiem Sephadex™ G-25, médiem SEC, které umožňuje účinné odstranění nízkomolekulárních látek z proteinů s molekulovou hmotností > 5000. Tyto kolony představují vynikající alternativu ke kolonám PD MidiTrap™ G-25 z důvodu větší kapacity objemu vzorku.

Pro větší flexibilitu má produkt dva alternativní aplikační protokoly, a to buď pomocí gravitace, nebo odstřeďování. Gravitační protokol umožňuje jednoduché čištění více vzorků paralelně bez nutnosti použití purifikačního systému. Při použití odstředivého protokolu se vzorky čistí ve standardní odstředivce s minimálním ředěním eluovaného vzorku.

Každé balení odsolovacích kolon PD-10 obsahuje 30 předbalených kolon. Pro zjednodušení používání odsolovacích kolon PD-10 s gravitačním protokolem lze použít pufrovací nádrž LabMate PD-10. Pomocí zásobníku pufrů lze promývací a ekvilibrační pufry použít v jednom kroku.

Typická separace je znázorněna na obrázku 2.14. Ačkoli obrázek ukazuje typické odsolení albuminu, jednalo by se o očekávaný výsledek odsolení protilátek.

Obrázek 2.14. Odstraňování chloridu sodného z roztoku albuminu. Odsolovací kolona PD-10 byla ekvilibrována destilovanou vodou. Vzorek obsahoval lidský sérový albumin (25 mg) rozpuštěný ve 2,5 ml 500 mM roztoku chloridu sodného. Celkem bylo získáno 23,8 mg albuminu v 3,5 ml eluentu, což odpovídá výtěžku 95,3 % (mezi šipkami). Počáteční celkový obsah soli ve vzorku před odsolením byl 2 %.

Gravitační protokol

Vyrovnávací paměť
Vyrovnávací paměť: Vhodný pro danou aplikaci

Postup při odsolování

1. Odřízněte spodní špičku, odstraňte horní uzávěr a vylijte přebytečnou kapalinu.
2. Pokud je k dispozici, namontujte na horní část odsolovací kolony PD-10 zásobník pufru LabMate a umístěte kolony do pracovní podložky PD-10.
3. Odsolovací kolonu vyrovnejte přibližně 25 ml pufru. Zlikvidujte flowthrough (k zachycení flowthrough použijte plastový zásobník).

Pro zajištění optimálních výsledků je rozhodující ekvilibrovat kolonu celkem 25 ml ekvilibračního pufru, aby se zcela odstranil zásobní roztok.

1. Přidejte vzorek o celkovém objemu 2,5 ml. Pokud je vzorek menší než 2,5 ml, přidávejte pufr, dokud nedosáhnete celkového objemu 2,5 ml. Vyhoďte flowthrough.
2. Elultujte 3,5 ml pufru a shromážděte flowthrough.

Pro odsolení větších objemů vzorků použijte kolonky HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8.

Výtěžnost závisí na typu proteinu. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. Výtěžnost a odsolovací kapacita jsou vyšší při použití gravitačního flow ve srovnání s centrifugací.

Protokol centrifugace

Pufr
Ekvilibrační pufr: Vhodný pro danou aplikaci

Postup při odsolování

1. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony
2. Odstraňte horní uzávěr a vylijte roztok pro uchovávání kolony. Pomocí kleští odstraňte horní filtr. Odstraňte spodní víčko.
3. Umístěte odsolovací kolonu PD-10 do 50ml sběrné zkumavky a připojte dodaný adaptér kolony k horní části zkumavky.
4. Vložte kolonu do zkumavky. Naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a nechte ekvilibrační pufr zcela proniknout do zaplněného lože. Postup opakujte třikrát, přičemž pokaždé zlikvidujte průsakovou vodu.
5. Zkontrolujte, zda je vpravo nahoře nahoře nahoře nahoře nahoře nahoře nahoře. Znovu naplňte kolonu ekvilibračním pufrem a odstřeďujte při 1000 x g po dobu 2 min a zlikvidujte flowthrough.

Pro zajištění optimálních výsledků je rozhodující ekvilibrovat kolonu celkem 25 ml ekvilibračního pufru (kroky 4 a 5), aby se zcela odstranil zásobní roztok.

6. Zkontrolujte, zda je kolona v pořádku. Pomalu přidejte 1,75 až 2,5 ml vzorku do středu zabaleného lůžka.
7. Přidejte 1,75 až 2,5 ml vzorku. Umístěte odsolovací kolonu PD-10 do nové 50ml sběrné zkumavky.
8. Vložte do zkumavky 50ml sběrné zkumavky. Eluujte centrifugací 1000 x g po dobu 2 min a sbírejte eluát.

Pro odsolování větších objemů vzorků použijte kolonky HiTrap^® a HiPrep™, tabulka 2.8.

Výtěžnost závisí na typu proteinu. Obvykle se výtěžnost pohybuje v rozmezí 70 % až 90 %. Koncentrace vzorku může výtěžnost zlepšit. Výtěžnost a odsolovací kapacita jsou vyšší při použití gravitačního flow ve srovnání s centrifugací.