Výběr soli a příprava pufru

Soli

Při HIC je proces vazby selektivnější než proces eluce, proto je nezbytné optimalizovat podmínky startovacího pufru. Správná volba soli a její koncentrace jsou nejdůležitějšími parametry, které ovlivňují kapacitu a konečnou selektivitu. Cílem je optimalizovat podmínky tak, aby bylo dosaženo požadované selektivity pro navázání cílového proteinu (proteinů) a zajištěno, že většina nečistot projde kolonou.

Vliv různých solí na hydrofobní interakci je vysvětlen v kapitole 1. V praxi sírany sodné, draselné nebo amonné účinně podporují interakce ligand-protein v HIC a mají stabilizační vliv na strukturu proteinu. Proto se nejčastěji používají soli (NH₄)₂SO₄., Na₂SO₄, NaCl, KCl a CH₃COONH₄. Obrázek 1 ukazuje příklad, jak mohou různé soli ovlivnit selektivitu. Zde bylo nejlepšího rozlišení čtyř standardních proteinů dosaženo při použití 1,7 M síranu amonného ve startovacím pufru.

Obrázek 1. Různé soli ovlivňují selektivitu: eluce probíhá v pořadí podle rostoucího elučního objemu: cytochrom C, lysozym, ribonukleáza A, α-chymotrypsinogen.

Stejně jako výběr média může být i výběr soli pro separaci HIC otázkou pokusu a omylu, protože každá sůl se liší svou schopností podporovat hydrofobní interakce. Se zvyšující se koncentrací soli se množství navázaného proteinu zvyšuje téměř lineárně až do určité koncentrace soli a při vyšších koncentracích se dále zvyšuje exponenciálním způsobem.

• Při dané koncentraci síran amonný často poskytuje nejlepší rozlišení ve srovnání s ostatními solemi a lze jej použít při koncentracích až 2 M.

• Síran amonný je v porovnání s ostatními solemi nejúčinnější.
• Při použití chloridu sodného jsou obvykle nutné koncentrace až 3 M.
• Síran sodný je velmi dobrým solícím činidlem, ale problémy s rozpustností bílkovin mohou vyloučit jeho použití při vysokých koncentracích.
• Síran amonný se nedoporučuje pro práci při hodnotách pH vyšších než 8,0.

Koncentrace soli

Obrázek 2. Koncentrace soli ve startovacím pufru ovlivňuje selektivitu a rozlišení.

Obrázek 2 ukazuje vliv koncentrace soli na selektivitu a rozlišení. V tomto příkladu je cílový protein posledním eluovaným píkem. Selektivita média je uspokojivá, protože protein eluuje v rámci gradientu a je dobře oddělen od kontaminantů. V (a) cílový protein eluuje v ostré zóně, ale až v pozdní fázi gradientu. Snížení počáteční koncentrace soli (b) poskytuje podobné rozlišení, ale zajišťuje, že kontaminanty, které se navázaly během dřívějších běhů (kdy byla použita vyšší koncentrace soli), nyní eluují během počátečního promývacího kroku. Váže se pouze cílový protein, čímž se snižuje riziko koelutace kontaminantu s cílovým proteinem a zvyšuje se kapacita kolony pro cílový protein. Průběh provedený při ještě nižší počáteční koncentraci soli (c) vykazuje dobrou selektivitu, ale nízkou účinnost pro cílový protein. Vzorek není při aplikaci dostatečně silně navázán, což má za následek výrazné rozšíření píku během eluce.

• Pokud se cílová molekula eluuje příliš pozdě nebo vůbec a přechod na jiné médium není možný, zkuste navázat v médiu s o 50 % nižším obsahem soli.
• Některé proteiny se při vysokých koncentracích soli začínají srážet. Může být nutné snížit koncentraci soli ve startovacím pufru, aby se zabránilo vysrážení během běhu. Opakované vkládání vzorku v malých množstvích může také pomoci zabránit ztrátě výtěžnosti v důsledku srážení.

Pufrovací ionty a pH

Výběr pufrovacích iontů není pro hydrofobní interakci rozhodující. Nejčastěji se používají fosfátové pufry.

Zvolené pH musí být kompatibilní se stabilitou a aktivitou proteinu a doporučuje se ověřit optimální podmínky pH pro každou konkrétní aplikaci. Nicméně v rozmezí pH 5-8,5 mají hodnoty pH velmi malý význam pro konečnou selektivitu a rozlišení HIC separace. Zvýšení pH oslabuje hydrofobní interakce a retence proteinů se výrazněji mění při hodnotách pH nad 8,5 nebo pod 5,0.

1. Zkontrolujte stabilitu při pH a koncentracích solí použitých při separaci, zejména pokud je prioritou obnovení biologické aktivity. Vyhněte se extrémním změnám pH nebo jiným podmínkám, které mohou způsobit inaktivaci nebo dokonce vysrážení.
2. Použijte koncentraci pufru, obvykle 20-50 mM, která je dostatečná k udržení pufrovací kapacity a pH během aplikace vzorku a změn koncentrace soli.
3. Převeďte přečištěný protein do těkavého pufru, pokud má být produkt lyofilizován. Tabulka 3 uvádí vhodné systémy těkavých pufrů.

Tabulka 3. Těkavé pufrovací systémy (* Handbook of chemistry and physics, 83. vydání, CRC, 2002-2003.)

rozsah pH	pufrovací systém	hodnoty pKa pro pufrování iontů*
3.3-4.3	Kyselina mravenčí	3,75
3.3-4,3; 4,8-5,8	Kyselina mravenčí / Pyridin	3.75; 5,25
3,3-4,3; 8,8-9.8	Kyselina mravenčí / Amoniak	3,75; 9,25
3.3-4,3; 9,3-10,3	Kyselina mravenčí / trimethylamin	3,75; 9,81
4.3-5,8	Kyselina octová / Pyridin	4,75; 5,25
4,3-5,3; 7,2-8.2	Kyselina octová / N-ethylmorfolín	4,75; 7,72
4.3-5,3; 8,8-9,8	Kyselina octová / amoniak	4.75; 9,25
4,3-5,3; 9,3-10,3	Kyselina octová / Trimethylamin	4,75; 9.81
5,9-6,9; 8,8-9.8	Uhličitan vodíku / čpavek	6,35; 9,25

• Připravte pufry při stejné teplotě, při které budou použity, abyste zajistili správné pH.
• Přefiltrujte pufry a vzorky po zahrnutí všech solí a přísad. Používejte vysoce kvalitní vodu a chemikálie. Pro média s velikostí částic nad 90 μm použijte filtry o průměru 1 μm, pro částice o velikosti 34 μm filtry o průměru 0,45 μm a pro částice o velikosti pod 15 μm nebo v případě, že jsou vyžadovány sterilní nebo extra čisté vzorky, použijte filtry o průměru 0,22 μm. Aby se zabránilo tvorbě vzduchových bublin v zabalené koloně a zajistila se reprodukovatelnost výsledků, měly by mít kolona a pufry při přípravě na běh stejnou teplotu.
• U vzorků s neznámými hydrofobními vlastnostmi zkuste následující:

Startovací pufr: 1,5 M síran amonný, 50 mM fosforečnan sodný, pH 7,0

Elution buffer: 50 mM fosforečnan sodný, pH 7,0

Pufrovací přísady

Přísady lze použít ke zlepšení selektivity a rozlišení, například když se protein příliš silně váže na HIC médium. Pokud se však použijí ve vysokých koncentracích, existuje riziko inaktivace a/nebo denaturace cílového proteinu. Aditiva mohou ovlivnit separaci zlepšením rozpustnosti proteinů, změnou konformace proteinů a podporou eluce vázaných proteinů. Nejpoužívanějšími aditivy při HIC separacích jsou alkoholy mísitelné s vodou, detergenty a chaotropní soli (omezené použití). Typické přísady jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4. Aditiva používaná ke zlepšení separace HIC.

Typ aditiv	Typická aditiva	Účinek
Alkoholy	Polarita pufru. Snižují povrchové napětí vody, čímž oslabují interakci a způsobují disociaci. Nepolární oblasti soutěží s proteiny o hydrofobní ligandy, což způsobuje disociaci.
Detergenty	Od 0,1 % do 1 % v/v Triton X-100	Jako výše.
Chaotropní soli	MgCl2 CaCl2 KI NaCNS až 8 M močoviny	Snižují hydrofobní účinek v roztoku, čímž oslabují interakci a způsobují disociaci. Může také ovlivnit konformaci proteinu. Ca2+ zvyšuje stabilitu při purifikaci proteinů vázajících vápník; Mg2+ stabilitu snižuje.

Spustit slepé eluční gradienty s obsaženými aditivy, abyste zkontrolovali jejich vliv na eluční profil (tj. provést běh, ale nevložit žádný vzorek).