Jak provést proteinový gel mPAGE™ pomocí elektroforézního systému Bio-Rad

1. Připravte běžící pufr
2. Připravte proteinový gel
3. Sestavte elektroforézní komoru
/li>
4. Připravit a vložit vzorky
5. Spustit gel
6. Vyjmout gel z kazety

*Tento protokol je použitelný pro systémy Bio-Rad Mini-PROTEAN^® Tetra, Mini-PROTEAN II^® a Mini-PROTEAN^® 3 pro elektroforézu.

Tipy a nejčastější dotazy

• Sestavení elektroforézní komory Bio-Rad s gely mPAGE™
• Výběr MES vs. MOPS Running Buffer for Protein Gel Electrophoresis
• Příprava vzorků a jejich načítání
• Jak spustit gel
• Snímání proteinového gelu

Sestavení elektroforetické komory Bio-Rad s mPAGE™ Gely

1. Převraťte těsnění běžícího modulu Bio-Rad ze standardního nastavení (obrázky 1-2). Pokud tento krok vynecháte, dojde k úniku jádra pufru do vnější komory.
2. Vložte gel mPAGE™ kratší destičkou směrem k vnitřnímu jádru komory.

Obrázek 1. Před umístěním gelu mPAGE™ je třeba otočit gumové těsnění v elektroforézní jednotce Bio-Rad.

Obrázek 2. Vlevo: Nesprávná orientace těsnění Bio-Rad pro použití s gely mPAGE™. Vpravo: Správná orientace těsnění Bio-Rad pro použití s gely mPAGE™.

Výběr pufru MES vs. MOPS pro gelovou elektroforézu bílkovin

Jsou dva pufry, které lze použít jako pufry pro gely SDS-PAGE: MES a MOPS. MES má nižší pKa než MOPS, což umožňuje rychlejší průběh gelu. Pufr MES umožňuje lepší separaci proteinů s nižší molekulovou hmotností, zatímco pufr MOPS umožňuje lepší separaci proteinů s vyšší molekulovou hmotností (obrázek 3).

• Pro rozlišení proteinů s malou molekulovou hmotností použijte pufr MES
• Pro rozlišení proteinů se střední a vysokou molekulovou hmotností použijte pufr MOPS

Obrázek 3. Výběr MES (levý obrázek) vs. MOPS (pravý obrázek) pufru pro gelovou elektroforézu proteinů mPAGE™ na základě velikosti proteinu a procenta akrylamidu v gelu. Velikost bílkovin pro odpovídající pásy uvedena v kDa. Menší proteiny jsou účinněji rozlišeny pomocí pufru MES; větší proteiny jsou účinněji rozlišeny pomocí pufru MOPS.

Příprava a načítání vzorků

1. Příprava vzorků těsně před elektroforézou podle tabulky 1.

Tabulka 1.

Reagencie	Redukovaný vzorek (µl)	Neredukovaný vzorek (µl)
Vzorky bílkovin	x	x
mPAGE™ 4X Sample Buffer	2.5	2.5
1 M DTT1	1	n/a
Deionizovaná voda	6.5 - x	7.5 - x
Celkový objem	10	10

2. Vzorky zahřívejte 10 minut při 70 °C (vzorky nevařte). Před vložením vzorků je krátce odstřeďte.
3. Pro vložení vzorků do jamek vložte špičku pipety vertikálně, abyste dosáhli optimálních výsledků při vkládání vzorků (Obrázek 4). Při vkládání vzorků nepřekračujte kapacitu jamek: 80 μl pro gely s 10 jamkami; 60 μl pro gely s 12 jamkami a 40 μl pro gely s 15 jamkami.

Obrázek 4. Nesprávný a správný úhel pipety při vkládání vzorků do předlitých gelů mPAGE™.

Jak spustit gel

1. Po vložení vzorků a naplnění pufrovacích komor nasaďte kryt na elektroforézní nádrž a zapojte elektrické vodiče do zdroje napájení.
2. Provádějte gel při konstantním napětí, dokud čelo barviva nedosáhne 2 mm od dna kazety s gelem. Doba běhu se může lišit v závislosti na procentuálním podílu gelu, běžícím pufru a použitém zařízení. Optimální napětí a typické doby běhu nejvhodnější pro zvolený gel a běžící pufr naleznete v tabulce 2. Při spuštění více než jednoho gelu v jedné elektroforézní nádrži by měly mít všechny gely stejné složení.

Tabulka 2.

% akrylamidu	mPAGE™ MES SDS Running Buffer 180 V	mPAGE™ MOPS SDS Running Buffer 200 V
Typický proud (počáteční - koncový)	Typická doba běhu	Typický proud (počáteční - koncový)	Typická doba chodu
8%	109-55 mA	22 min	103-47 mA	27 min
10 %	105-50 mA	26 min	97-48 mA	31 min
12%	100-46 mA	30 min	97-42 mA	34 min
4-12%	107-53 mA	26 min	97-41 mA	36 min
4-20%	106-44 mA	40 min	87-40 mA	34 min
8-16%	113-48 mA	32 min	93-44 mA	31 min

Odstranění proteinového gelu

1. Vypněte napájení, sejměte kryt z elektroforézy a vyjměte gel.
2. Pomocí otvírače gelových kazet mPAGE™ uvolněte gelové destičky (Obrázek 5). Gel Cassette Opener lze vložit mezi dvě plastové gelové desky uzavírající gel a použít jej jako páku k oddělení desek. Nezapomeňte otvírákem na kazety uvolnit gelové desky na obou stranách gelu.

Obrázek 5.

3. Podržte gel ve vodorovné poloze a opatrně zvedněte horní desku.
4. Pomalu odlepte gel od spodní desky a vložte jej do pufru nebo destilované vody pro přípravu na barvení nebo blotování.