Nukleáza CRISPR Cas 9 řízená RNA pro úpravu genomu
Co je CRISPR/Cas?
CRISPR je zkratka pro Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (pravidelně rozložené krátké palindromické repetice). Objev prokaryotického "imunitního systému" CRISPR typu II umožnil vývoj pro nástroj pro úpravu genomu řízený RNA, který je jednoduchý, snadný a rychle proveditelný. Zkratka CRISPR se obvykle vyslovuje jako slovo, "crisper."
Jak funguje CRISPR/Cas?
Cesta CRISPR byla objevena u bakterií, kde funguje podobně jako imunitní systém proti napadení viry a plazmidovou DNA. Krátké sekvence DNA (spacery) z napadajících virů jsou začleněny do lokusů CRISPR v bakteriálním genomu a slouží jako "paměť" na předchozí infekci. Opětovná infekce spustí komplementární zralou CRISPR RNA (crRNA), aby našla odpovídající sekvenci - což poskytne nukleáze spojené s CRISPR (Cas) specifičnost pro vytvoření dvouřetězcového zlomu na specifických "cizích" sekvencích DNA.
Obrázek 1.Genomické cílové místo
Jak funguje CRISPR Cas9?
Pro vytvoření takového nástroje byla endogenní dráha CRISPR redukována na dvě hlavní složky: nukleázu Cas9 a vodicí RNA (gRNA)1-7. Vodicí RNA je dvousložkový systém sestávající z crRNA a tracrRNA. CrRNA se zaměřuje na dvouvláknovou DNA, která má být přestřižena, a má krátkou homologickou oblast, která jí umožňuje navázat tracrRNA. tracrRNA poskytuje strukturu kmenové smyčky, která se spojuje s proteinem Cas9. Duplex crRNA:tracrRNA se označuje jako gRNA. Nukleáza Cas9 a gRNA tvoří ribonukleoprotein Cas9 (RNP), který se může vázat a řezat specifický cíl DNA v kontextu celého genomu. Aby mohl být cíl štěpen RNP, musí mít dvě specifické sekvence. Za prvé, gRNA vyžaduje 17-21 bází homologie RNA-DNA, která se nazývá protospacer. Za druhé, protein Cas9 vyžaduje krátký motiv přiléhající k protospaceru (PAM), aby se mohl navázat na cílovou DNA (obrázek 2). Pokud je přítomna spojovací tracrRNA a mezi gRNA a genomovým cílem existuje dostatečná homologie, RNP rozštěpí obě vlákna cílové DNA a vytvoří DSB v tomto přesném místě genomu.
Obrázek 2.Schéma dvojitého řetězce cíleného na CRISPR/Cas.
Ačkoli funkční CRISPR v jádře je ve formě RNP, prvky CRISPR jako molekulárního nástroje jsou vhodné pro různé způsoby doručení. Prvními experimenty se podařilo vytvořit chimérickou jednoduchou vodicí RNA neboli sgRNA, která kombinuje crRNA a tracrRNA do jediného vlákna RNA, nikoli do duplexu, který se vyskytuje v přírodě. Tuto sgRNA a Cas9 mRNA lze exprimovat z jediného plazmidu pro přímou transfekci nebo zabalení do částic pro transdukci lentiviry. Případně lze rekombinantní Cas9 protein kombinovat se synteticky vyrobenou crRNA a tracrRNA a vytvořit RNP pro transfekci nebo mikroinjekci do embryí.
Potřebujete pomoc s použitím proteinů Cas9?"
Po cílené tvorbě DSB buňka obvykle použije jednu ze dvou cest opravy DNA, aby přežila: NHEJ (non-homologous end joining) nebo HDR (homology dependent repair). Tyto opravné mechanismy se často dopouštějí chyb, což vede k mutagenezi v cílovém místě buď narušením kódující sekvence za účelem funkční inaktivace nebo vyřazení genu (NHEJ), nebo přidáním nové sekvence DNA za účelem vyřazení specifických sekvenčních změn (HDR). Systém CRISPR/Cas9 tak umožňuje trvalé, dědičné modifikace chromozomální DNA. Kromě toho lze systém CRISPR použít jako cílený doručovací systém, kdy jsou endonukleázové domény Cas9 inaktivovány a připojeny k jiným efektorovým molekulám, aby působily na určeném místě gRNA v genomu. Tím se funkce systému CRISPR rozšiřují na aktivaci a inhibici genů. V neposlední řadě lze systém CRISPR využít ke screeningu. Všechny čtyři základní způsoby využití systému CRISPR/Cas9 - knockoutování genů, knock-in genů, aktivace nebo inhibice genů a screening - jsou dále popsány níže.
Knockout genu
CRISPR/Cas9 vytváří knockoutované buňky nebo zvířata, pokud jsou exprimovány společně s gRNA specifickou pro cílový gen. Účelem genového knockoutu je odhalit funkci genu narušením jeho exprese v buňce. Společně exprimovaná, správně navržená gRNA nasměruje Cas9 ke štěpení cílové sekvence a vytvoření DSB v genu, který je předmětem zájmu. Vyřazení genu lze pak dosáhnout jedním ze tří způsobů: 1) buňka opraví zlom pomocí NHEJ, což vede k náhodným inzercím nebo delecím ("indelům") v otevřeném čtecím rámci (ORF) rozštěpeného genu; 2) buňka opraví zlom pomocí HDR z uživatelem dodané šablony, přičemž do ORF vloží specifickou rušivou sekvenci; 3) dvojice gRNA vytvoří dva DSB, které obklopují základní kódující sekvenci, což vede k jejímu vyříznutí.
NHEJ je nejaktivnějším opravným mechanismem, je však náchylný k chybám a často zavádí posun rámce, což způsobuje předčasný stop kodon a/nebo způsobuje, že výsledný transkript je zaměřen na rozpad zprostředkovaný nesmyslem (NMD). Modifikace frameshiftů mohou způsobit zavedení předčasných stop kodonů do transkriptu, což zabrání překladu kritických částí aminokyselinového řetězce, a výsledkem je abnormálně krátký, nefunkční protein. Nonsense-mediated decay funguje tak, že snižuje počet chyb v genové expresi tím, že eliminuje transkripty mRNA, které obsahují předčasné stop kodony. Předpokládá se, že tato kontrolní dráha se aktivuje, když komplexy exon-exon junction - bílkovinné komplexy, které se tvoří na pre-mRNA řetězci mezi exony během sestřihu RNA - nejsou ribozomem po sestřihu transkriptu správně odstraněny. Pokud komplex exon-exonového spojení zůstane vázán v důsledku posunu rámce v horním řetězci, je transkript signalizován k degradaci a funkční protein není nikdy přeložen. Obě tyto cesty účinně narušují funkci genu v buňce.
Gene Knock-in
CRISPR/Cas9 lze také použít k zavedení, neboli "knock in", nových sekvencí DNA. Mezi běžné modifikace patří zavedení jednonukleotidového polymorfismu (SNP), malé značky, loxP nebo větší kazety, například fluorescenčního proteinu. Tyto modifikace se provádějí prostřednictvím DSB vyvolaného Cas9 na určitém místě, což výrazně zvyšuje možnost cílené integrace. K cílené integraci (genovému knock-in) dochází prostřednictvím HDR. Aby bylo možné editovat gen pomocí HDR, musí být do buňky dodána DNA "dárcovská" nebo opravná šablona obsahující požadovanou sekvenci, obvykle na dárcovském plazmidu nebo oligonukleotidu, spolu s gRNA a Cas9. Účinnost genového knock-inu je obecně nižší než u knockoutu (<10 % modifikovaných alel), ale lze jej použít k vytvoření specifických modifikací od změny jednoho nukleotidu až po rozsáhlé inzerce.
Aktivace a inhibice genů
Kromě toho, že CRISPR funguje jako nástroj pro editaci genomu, lze jej použít také jako cílený systém pro přenos dalších funkčních proteinů. Jedinečnou vlastností Cas9 je jeho schopnost vázat cílovou DNA nezávisle na štěpení DNA, protože se jedná o dva samostatné kroky mechanismu Cas9. Divoký typ Cas9 má dvě nukleázové domény: RuvC a HNH. Aby se dosáhlo vazby bez štěpení, jsou obě nukleázové domény zneaktivněny indukcí bodových mutací (D10A a H840A u SpCas9), což vede ke vzniku nukleázově mrtvého Cas9 (dCas9). V kombinaci s gRNA cílenými na startovací místa transkripce bylo zjištěno, že samotná dCas9 stačí ke snížení nebo inhibici transkripce zablokováním její iniciace. Po tomto vývoji začali vědci experimentovat s transkripčními represory a aktivátory navázanými na dCas9. Transkripční represorová doména KRAB byla fúzována s dCas9 jako způsob transkripčního umlčování zprostředkovaného efektorovou doménou. dCas9 byl také fúzován s transkripčními aktivátory a transkripčními efektorovými proteiny. DCas9 pro aktivaci je široce populární oblastí studia a zahrnuje systémy jako dCas9-VP64, dCas9_SunTag, dCas9-SAM, dCas9-RNA Scaffold a dCas9-VPR. V naší nabídce produktů jsme fúzovali dCas9 s katalytickou doménou jádra histon acetyltransferázy (HAT) lidského proteinu P300 asociovaného s E1A. V kombinaci s gRNA zaměřenými na místa startu transkripce a oblasti zesilovačů řídí dCas9-P300 acetylaci histonů, čímž uvolňuje DNA z heterochromatického stavu a reguluje genovou expresi prostřednictvím endogenních buněčných mechanismů v přirozeném chromozomálním kontextu. Přístup dCas9-P300 k acetylaci histonů představuje odlišný mechanismus účinku ve srovnání s dCas9-VP64 nebo jinými podobnými motivy aktivace genů.
Screening
Screeny umožňují rychlý průzkum velkého počtu kandidátních genů nebo genomických míst z hlediska zapojení do vaší dráhy nebo fenotypu, který vás zajímá. Zlepšení ve výrobě sdružených oligo genů a zpracování velkého množství dat v kombinaci s efektivitou lentivirového přenosu umožňují výzkumným pracovníkům zvažovat tisíce kandidátních genů najednou, a to buď jako knihovnu, nebo jako cílenější panel. Knihovny definujeme jako kolekce klonů CRISPR pro celý genom; panely jsou menší podskupiny genů. Obecně lze panely a knihovny sestavit ve dvou formátech: (tisíce gRNA v jedné zkumavce) nebo arrayed (jedna gRNA na jamku v 96jamkových destičkách). Oba přístupy poskytují rychlé odpovědi na rozsáhlejší otázky a nabízejí významné výhody oproti dřívějším metodám, které vyžadovaly časově a pracovně náročný proces dotazování kandidátních genů po jednom.
Nabízíme celou řadu screeningových řešení, včetně sdružených knihoven GeCKO z Broad a Sanger Arrayed Whole Genome Lentiviral CRISPR Library k provádění rozsáhlých screeningů genových knockoutů(8). A brzy se objeví sdružené knihovny CRISPR/Cas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) pro celogenomový screening fenotypů transkripční aktivace u lidí a myší!
Co je CRISPR/Cas9?
Systémy CRISPR/Cas9 byly objeveny v roce 1993 a ukázalo se, že se vyvinuly v bakteriálních a archeálních organismech jako obrana proti virům a cizím plazmidům. Funkce nativní dráhy CRISPR spočívá v cílení nukleáz na invazivní DNA, čímž vzniká potenciálně smrtelný dvouřetězcový zlom (DSB). Krátce poté, co byla funkce této dráhy rozpoznána, byl systém CRISPR/Cas9 typu II z bakterie Streptococcus pyogenes (SpCas9) znovu použit k vytvoření jednoduchého, ale výkonného molekulárního nástroje, který lze naprogramovat tak, aby nukleázy cílil na konkrétní genomovou sekvenci.
Naše úloha při vývoji CRISPR/Cas9
Jsme hrdí na to, že můžeme globální výzkumné komunitě nabídnout naši nejnovější řadu nástrojů pro úpravu genomu CRISPR. Jako první společnost, která před téměř deseti lety komerčně nabídla technologii cílené editace genomu, nemá nikdo v této oblasti více zkušeností než my. Tyto zkušenosti jsou obzvláště důležité při vytváření nástrojů pro editaci genomu, které mají kritické požadavky na specifické zacílení a robustní řeznou aktivitu. Obojí poskytujeme v naší nové produktové řadě CRISPR a nyní vám dáváme naše dovednosti do rukou pomocí rychlé a jednoduché webové návrhové platformy. Naše produkty CRISPR si můžete objednat přímo prostřednictvím níže uvedeného odkazu nebo si prohlédnout obsah CRISPR na této stránce a dozvědět se o této technologii více.
Expresní plazmidy Cas9 a vodicí RNA (gRNA) připravené k použití typu "vše v jednom"
- Kodonově optimalizovaný protein Cas9 a gRNA jsou exprimovány z jediného vektoru a jsou dodávány jako DNA připravená
k použití, transfekční kvality. - Jedinečná místa CRISPR předem navržená tak, aby se minimalizoval off-targeting, jsou k dispozici pro kódující oblasti lidského, myšího a potkaního genomu. Vlastní návrhy pro jakékoli jiné oblasti nebo druhy jsou vždy k dispozici na vyžádání (viz Formulář žádosti o CRISPR na zakázku).
- GFP nebo RFP je fúzován s C-koncem Cas9 pomocí peptidu 2A, což umožňuje sledování účinnosti transfekce a obohacení aktivity editace genomu pomocí třídění FAC.
Obrázek 3.Formát jednoho plazmidu CRISPR/Cas
CRISPR Paired Nickases
- Párové nikázyCRISPR dále minimalizují necílové dvouřetězcové zlomy tím, že vyžadují nezávislou vazbu dvou samostatných gRNA na lokalizovanou genomickou oblast.
- V přítomnosti nukleázy Cas9-D10A vyvolávají obě gRNA jednořetězcové zlomy na opačných vláknech DNA, čímž vzniká funkční dvouřetězcový zlom.
- Předem navržené unikátní párové nikázy CRISPR jsou k dispozici pro kódující oblasti lidského, myšího a potkaního genomu (Paired Nickases Predesigns). Návrhy pro jakékoliv jiné oblasti nebo druhy jsou k dispozici jako zakázková žádost (viz Formulář žádosti o CRISPR na zakázku).
- Při objednání párových nikáz CRISPR pro konkrétní cíl obdrží výzkumní pracovníci dva samostatné, k použití připravené transfekční plazmidy exprimující gRNA z lidského promotoru U6. Nukleáza Cas9-D10A musí být zakoupena samostatně buď jako plazmid, nebo jako mRNA.
Obrázek 4.Párové nikázy Cas9
Obrázek 5.CRISPR Cas3
Párové nikázy Cas9 - Pro optimální funkčnost párové nikázy Cas9-D10A by měly být vodicí RNA navrženy v orientaci 5'-do-5' s rozestupem PAM mezi 30 a 150 bp.
Purifikovaná vodicí RNA
- Připravené k použití gRNA ve formátu purifikované RNA vhodné pro mikroinjekce nebo buněčné kultury.
- Navrženo podle stejně přísných pravidel jako naše plazmidy CRISPR a CRISPR s párovou nikázou.
- Formát CRISPR RNA je ideální pro výzkumníky vytvářející transgenní zvířecí modely nebo pro ty, kteří se obávají integrace genomických plazmidů.
- Ve formátu RNA není potřeba specifický promotor, což umožňuje expresi ve většině známých typů buněk a organismů.
- Divoký typ Cas9 (CAS9P) nebo Cas9-D10A nicking (CAS9D10AP).) nukleázy je třeba zakoupit samostatně buď jako plazmid, nebo jako mRNA (CAS9MRNA, CAS9D10AMRNA).
- K dispozici jsou návrhy pro dárce.
CRISPR Lentivirus
- Lentivirus CRISPR pro vysoce účinné knockoutovací obrazovky
- Formát lenti umožňuje účinnou chromozomální integraci komponent CRISPR.
- Transdukujte buňky pomocí našeho jedinečného formátu CRISPR s jedním lentivirem, který obsahuje Cas9 ORF obklopený prvky puro a GFP, což poskytuje více možností sledování stabilních buněčných populací.
- Umožňuje editaci genomu i u obtížně transfekovatelných buněk.
- Vyberte si z našich předpřipravených míst CRISPR nebo zadejte vlastní cíle
Obrázek 6. Lentivirální CRISPR:(A) Mapa vektoru lenti CRISPR all-in-one. (B) Signál GFP po transdukci buněk HEK293 částicemi vytvořenými pomocí pLV-U6g-EPCG. (C) HeLa buňky byly transdukovány lentivirem (pLV-U6g-EPCG) s následnou selekcí na puromycin a ošetřením 6TG za účelem obohacení o knockouty HPRT1. Inzerce a delece byly detekovány v cílovém místě gRNA pomocí testu neshody (CEL-I).
CRISPR pozitivní a negativní kontroly
- Testovaná a validovaná pozitivní kontrola pro lidský gen EMX1 poskytuje referenční základ a umožňuje výzkumným pracovníkům provádět vedle sebe hodnocení účinnosti jejich experimentů s editací genomu.
- Připravené k použití lidské pozitivní kontroly genu EMX1 pro obě jednotlivé gRNA (.CRISPR01-1SET) a CRISPR párové nikázy (CRISPR02-1SET) jsou k dispozici.
- Každá lidská pozitivní kontrola EMX1 je dodávána s alikvotem buď divokého typu Cas9 (CRISPR01-1SET) nebo niklasa Cas9-D10A nukleáza (CRISPR02-1SET).
- CRISPR univerzální negativní kontroly (CRISPR06-1EA, CRISPR07-1EA, CRISPR08-1EA) jsou plazmidy typu "vše v jednom", připravené k použití, určené k transfekci, exprimující nukleázu Cas9 divokého typu pod promotorem CMV spolu s a sekvencí gRNA navrženou tak, aby necílila na žádný známý lidský, myší nebo potkaní gen.
Obrázek 7.Obraz CEL I pozitivní kontroly CRISPR01 (pruh označený EMX1s4+Cas9) a pozitivní kontroly CRISPR02 (pruh označený EMX1s4, EMX1as4+D10A).
Network error: Failed to fetch
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?Toto je strojově přeložená stránka.
