Protokoly ribonukleoproteinů (RNP) s použitím syntetických sgRNA a proteinů Cas9

Použití CRISPR RNP pro úpravu genomu

Ačkoli systém CRISPR lze do buněk dopravit prostřednictvím plazmidů, přímé zavedení Cas9 RNP posiluje a rozšiřuje možnosti použití technologie modifikace genomu CRISPR tím, že eliminuje možnost integrace DNA plazmidů do hostitelského genomu. Komplexy RNP nabízejí rychlejší editaci genů, protože funkční nukleáza je v buňce okamžitě k dispozici a komplexy jsou rychle degradovány a odstraněny, takže editační aktivita je krátkodobá. Zkrácená doba dostupnosti RNP v buňkách vede ke snížení off-target efektů.

Obrázek 1. Schéma jednodílného a dvoudílného systému CRISPR s proteinem Cas9, které ukazuje složení ribonukleoproteinu (RNP). Po vytvoření dvouřetězcového zlomu se buněčný mechanismus DNA ubírá dvěma možnými cestami opravy: NHEJ (Non-Homologous End Joining), tvorba indelů nebo HDR (Homology-Directed Repair) pro cílené inzerce nebo knock-iny.

Podrobné protokoly

Naše syntetické vodiče jsou kompatibilní s celou řadou aplikací pro úpravu genů. Ať už potřebujete pokyny pro obecné použití, nukleofekci & mikroinjekci embryí, editaci T buněk nebo protokoly pro iPSC. Najdete zde také pomoc s následným hodnocením účinnosti štěpení, izolací klonů &; screeningem a řešením problémů.

Primární editace T-buněk pomocí RNP

Experimenty s editací genomu na bázi ribonukleoproteinů (RNP) nebyly nikdy jednodušší než se syntetickými syntetickými vodicími RNA a proteiny Cas9 společnosti Sigma-Aldrich^®, nicméně některé buňky mohou být obtížněji editovatelné než jiné. Rozsáhle jsme ověřili naše činidla a protokoly pro práci v těch nejnáročnějších aplikacích, včetně primárních T-buněk, které představují řadu významných problémů, jež je třeba překonat při pokusu o knock-in nebo knockoutování konstruktu nebo genu. Pomocí sgRNA však lze dosáhnout editace v primárních lidských T buňkách s účinností a specifičností, které převyšují dvoudílné vodicí systémy (obrázek 2 na níže uvedeném datovém listu) Jak v primárních T buňkách, tak v PBMC lze pro jistotu použít Sigma-Aldrich^® sgRNA lze zavést jako vysoce specifické párové nikázy a nikázy Cas9 nebo jako proteiny SpCas9 s jedním místem, aby bylo dosaženo úplného vyřazení genu PD-1, měřeno expresí PD-1 a NGS (obrázek 2 z níže uvedeného datového listu). sgRNA lze rychle navrhnout pro jakýkoli gen buď jako samostatnou cílovou RNA, nebo jako součást párového systému nikáz, což je ideální pro různé typy lidských buněk, včetně primárních T-buněk. Nukleázy Cas, pokud jsou dodávány ve formátu proteinu, předem zkomplexovaného s jedinou modifikovanou vodicí RNA (gRNA), a nikoli zakódovaného na plazmidu, umožňují výzkumníkům obejít historicky limitující faktory použití CRISPR v terapeutické sféře, kterými jsou účinky mimo cíl, nízká účinnost a nežádoucí buněčné reakce na cizí DNA. Když potřebujete mít jistotu, Sigma-Aldrich^® sgRNA jsou jediné vodicí RNA, které jsou plně podpořeny 100% zárukou účinnosti - předem navržené a vlastní sekvence.

Obrázek 2. Editace pomocí RNP nikázových systémů s jedinou aktivní řezací doménou a následné dodání pomocí proximálních vodicích RNA v páru umožňuje přesné dvouvláknové zlomy a poskytuje hyper-specifickou a účinnou editaci genomu v typech buněk, které se editují obtížněji.

Ověřená vysoce výkonná editace genů v myších embryích

Vytváření myších modelů je pracný a nákladný proces, který je však zásadní pro základní výzkum v oblasti poznání zdraví a nemocí. Výkonnost sgRNA společnosti Sigma-Aldrich^® byla testována na nejvyšší úrovni pro aplikace genomového inženýrství v myších embryích porovnáním našich sgRNA s ostatními špičkovými poskytovateli na několika genomových místech v myších embryích.

Vícenásobné replikace v každém místě při porovnávání vedle sebe odhalily rozdíly v účinnosti editace mezi identickými cíli sgRNA mezi Sigma-Aldrich^® sgRNA a ostatními špičkovými poskytovateli. Experimenty prováděné paralelně nezávislým, významným, myším jádrovým pracovištěm ukazují lepší výkonnost jednotlivých vodítek Sigma-Aldrich^® v účinnosti střihu. Navíc nedošlo ke zvýšení toxicity pro přežití embryí. Souhrnně, data ukazují, že naše vysoce aktivní a čisté sgRNA poskytují lepší editaci genů v experimentech prováděných nezávislým pracovištěm ve srovnání s konkurencí nezávislou na mikroinjekci nebo elektroporaci embryí.

Obrázek 3. Editace genů u myších embryí je tradičně zdlouhavý proces, avšak editace pomocí RNP s CRISPR tuto složitost snižuje. Myší modely lze vytvářet rychle, a to pro téměř jakýkoli cíl. Naše syntetické sgRNA jsou vhodné jak pro mikroinjekci, tak pro elektroporaci embryí.

Související produkty

Tabulka 1: Produkty proteinu Cas9

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

Tabulka 2: Další související produkty

Litujeme, vyskytla se neočekávaná chyba.

Network error: Failed to fetch

EMBRYO CULTURE MEDIA	Myší embryokultivační média a reagencie testované na myších embryích
BUNĚČNÁ KULTURA	Kompletní katalog buněk a reagencií pro buněčné kultury

Řešení problémů

Pokud není pozorováno žádné řezání a existuje důvodné podezření, že je na vině experimentální chyba, mohou při řešení problémů pomoci následující úvahy.

Podezření na problém	Řešení
Protein Cas9 se po dlouhodobém skladování v ředicím pufru denaturoval.	Předložený ředicí pufr se doporučuje pouze k okamžitému použití. Pro dlouhodobé skladování uchovávejte protein lyofilizovaný nebo resuspendovaný v dodaném rekonstitučním roztoku při -20 ℃.
Protein Cas9 byl příliš mnohokrát rozmrazen a znovu zmrazen.	Bylo prokázáno, že protein Cas9 vydrží několik kol zmrazování a rozmrazování bez ztráty řezné aktivity, ale alikvotní rozdělení proteinu na menší množství při resuspenzi umožní tomuto potenciálnímu problému předejít.
KrRNA a tracrRNA musí být před komplexací s proteinem Cas9 žíhány.	Ačkoli krok žíhání není obecně nutný, ukázalo se, že ve vzácných případech zvyšuje řeznou aktivitu. Pro žíhání crRNA a tracrRNA je smíchejte v požadovaném poměru a inkubujte směs 5 minut při 95 ℃, poté směs umístěte na 20 minut na led.
CrRNA a tracrRNA jsou degradovány.	Za běžných podmínek buněčné kultury není ke stabilizaci syntetické RNA zapotřebí modifikace; u některých buněčných linií to však může být nezbytné. Modifikace jsou k dispozici u nás.
Transfekce nebo nukleofekce nefunguje nebo je příliš toxická.	U každého transfekčního činidla nebo nukleofekce optimalizujte protokol pro každou použitou buněčnou linii. Další pomoc naleznete v protokolu výrobce.
In vitro transkribovaná RNA je nekvalitní nebo degradovaná.	Pro optimální výkonnost používejte pouze RNA ověřenou na kvalitu IVT.