Derivatizace mastných kyselin na FAME

GC lze použít k analýze mastných kyselin buď jako volných mastných kyselin, nebo jako metylesterů mastných kyselin. Mezi hlavní důvody, proč analyzovat mastné kyseliny jako metylestery mastných kyselin, patří:

• Ve volné, nedostatečně hydratované formě mohou být mastné kyseliny obtížně analyzovatelné, protože tyto vysoce polární sloučeniny mají tendenci vytvářet vodíkové vazby, což vede k problémům s adsorpcí. Snížení jejich polarity je může učinit přístupnějšími pro analýzu.
• Pro rozlišení velmi malých rozdílů, které vykazují nenasycené mastné kyseliny, musí být polární karboxylové funkční skupiny nejprve neutralizovány. To pak umožňuje kolonové chemii provádět separace podle bodu varu eluce a také podle stupně nenasycenosti, polohy nenasycenosti, a dokonce podle cis vs. trans konfigurace nenasycenosti.

Esterifikace mastných kyselin na metylestery mastných kyselin se provádí pomocí alkylačního derivatizačního činidla. Metylestery mají vynikající stabilitu a poskytují rychlé a kvantitativní vzorky pro GC analýzu. Reakce esterifikace zahrnuje kondenzaci karboxylové skupiny kyseliny a hydroxylové skupiny alkoholu. Esterifikace se nejlépe provádí za přítomnosti katalyzátoru (např. trichloridu boru). Katalyzátor protonizuje atom kyslíku karboxylové skupiny, čímž se kyselina stává mnohem reaktivnější. Alkohol se pak spojí s protonovanou kyselinou za vzniku esteru se ztrátou vody. Katalyzátor se odstraní s vodou. Použitý alkohol určuje délku alkylového řetězce výsledných esterů (při použití methanolu vznikají methylestery, zatímco při použití ethanolu ethylestery). Následující typický postup esterifikace (za použití BCl₃-methanolu) je určen jako vodítko. Může být nutné jej upravit tak, aby vyhovoval potřebám konkrétní aplikace.

• Vzorky lze derivatizovat čisté nebo po rozpuštění v rozpouštědle. Je-li to vhodné, rozpusťte vzorek v nepolárním rozpouštědle (např. hexanu, heptanu nebo toluenu). Pokud je vzorek ve vodném rozpouštědle, nejprve jej odpařte do sucha a poté použijte čistý nebo rozpuštěný v organickém nepolárním rozpouštědle.
• Navažte 1-25 mg vzorku do 5-10 ml mikroreakční nádobky.
• Přidejte 2 ml BCl₃-methanolu, 12 % w/w. V této fázi lze přidat zachycovač vody (např. 2,2-dimethoxypropan).
• Zahřívejte při 60 °C po dobu 5-10 minut. Doba derivatizace se může lišit v závislosti na konkrétní derivatizované sloučenině (sloučeninách).
• Ochlaďte, poté přidejte 1 ml vody a 1 ml hexanu.
• Reakční nádobou zatřepejte (je důležité, aby se estery dostaly do nepolárního rozpouštědla).
• Poté, co necháte vrstvy usadit, opatrně přeneste horní (organickou) vrstvu do čisté lahvičky. Organickou vrstvu vysušte buď a) průchodem vrstvou bezvodého síranu sodného během kroku přenosu do čisté lahvičky, nebo b) přidáním bezvodého síranu sodného do čisté lahvičky a následným protřepáním.
• Pro stanovení správné doby derivatizace analyzujte alikvoty reprezentativního vzorku s použitím různých dob derivatizace. Sestavte graf závislosti plochy píku (osa y) na době derivatizace (osa x). Minimální doba, kterou je třeba použít, je taková, kdy se zvyšující se dobou derivatizace není pozorován další nárůst plochy píku (kdy se křivka stává plochou).
• Pokud je podezření, že úplné derivatizace nebylo nikdy dosaženo, použijte další činidlo nebo přehodnoťte teplotu.
• Je důležité připravit spolu se vzorky slepý vzorek činidla, aby bylo možné identifikovat případné problémy.

Je důležité používat pouze vysoce kvalitní derivatizační činidla, aby bylo zajištěno, že během analýzy nedochází k artefaktům. Kromě toho by se měla používat pouze derivatizační činidla s nízkou vlhkostí, protože esterifikační reakci bude bránit přítomnost vody. Podmínky skladování derivatizačních činidel by měly být přísně dodržovány, protože některá z nich jsou náchylná k degradaci během dlouhodobého skladování.