Protokoll für das REDExtract-N-Amp™ Gewebe-PCR-Kit

Produktnummern. XNATS, XNAT, XNATR

Überblick

Das REDExtract-N-Amp™ Gewebe-PCR-Kit enthält alle Reagenzien, die für die schnelle Extraktion und Amplifikation genomischer DNA aus Mäuseschwänzen und anderen tierischen Geweben, Wangenabstrichen, Haarschäften und Speichel benötigt werden. Die DNA wird aus dem Ausgangsmaterial freigesetzt, indem die Probe 10 Minuten lang mit einer Mischung aus Extraktionslösung und Gewebepräparationslösung bei Raumtemperatur inkubiert wird. Es ist kein mechanischer Aufschluss, keine organische Extraktion, keine Säulenaufreinigung und keine Ausfällung der DNA erforderlich.

Nach Zugabe der Neutralisierungslösung B ist der Extrakt für die PCR bereit. Ein Aliquot des neutralisierten Extrakts wird dann mit der REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsmischung und vom Benutzer bereitgestellten PCR-Primern kombiniert, um die Ziel-DNA zu amplifizieren. Die REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsmischung ist eine 2X-Reaktionsmischung, die Puffer, Salze, dNTP und Taq-Polymerase enthält. Sie ist speziell für die Verwendung mit den Extraktionsreagenzien optimiert. Sie enthält außerdem den JumpStart™ Taq-Antikörper für die Hot-Start-PCR, um die Spezifität zu erhöhen, und den REDTaq^® Farbstoff, um das direkte Beladen eines Agarosegels mit dem PCR-Produkt zu ermöglichen.

Mitgelieferte Reagenzien	Bestellnummer	XNATS 10 Vorb., 10 PCR	XNAT 100 Vorb., 100 PCR	XNATR 1000 Vorb., 1000 PCR
Extraktionslösung	E7526	2,5 ml	24 ml	240 ml
Gewebevorbereitungslösung	T3073	0,3 ml	3 ml	30 ml
Neutralisationslösung B	N3910	2,5 ml	24 ml	240 ml
REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsmischung Dies ist eine 2X-PCR-Reaktionsmischung, die Puffer, Salze, dNTP, Taq-Polymerase, REDTaq® Farbstoff und JumpStart Taq-Antikörper enthält.	R4775	0,15 ml	1,2 ml	12 ml

Erforderliche Reagenzien und Ausrüstung, nicht im Lieferumfang enthalten:

• Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 oder 2 ml) oder Multiwell-Platte für Extraktionen (200 μl Mindestvolumen pro Well)
• Schere, mikro-sezierend, Katalog-Nr. Z265985
• Pinzette (klein bis mittelgroß)
• Stäbchen für Wangenabstrich (Steriler Applikator mit Schaumstoffspitze, Katalognummer A9601
• Probenahmekarte - Blutfleckenkarte, Katalognummer C2613
• Röhrchen oder Platte für die PCR
• Heizblock oder Thermocycler bei 95 °C
• PCR-Primer
• Thermocycler
• Wasser, PCR-Reagenz, Katalog-Nr. W1754
  

Durchführung

Alle Schritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.

A. DNA-Extraktion aus Mäuseschwänzen, Tiergeweben, Haaren oder Speichel

1. 100 μl der Extraktionslösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen oder Well einer Multiwell-Platte pipettieren. 25 μl der Gewebevorbereitungslösung in das Röhrchen oder Well geben und zum Mischen auf und ab pipettieren.
   
   Hinweis: Wenn mehrere Extraktionen durchgeführt werden, können ausreichende Volumen der Extraktions- und Gewebevorbereitungslösungen bis zu 2 Stunden vor der Verwendung im Verhältnis 4:1 vorgemischt werden.
   
2. Für frische oder gefrorene Mäuseschwänze: Spülen Sie die Scheren und Pinzetten vor dem Gebrauch und zwischen verschiedenen Proben mit Ethanol 70 %. Legen Sie ein 0,5-1 cm langes Stück einer Mausschwanzspitze (mit dem abgeschnittenen Ende nach unten) in die Lösung. Durch Vortexen oder Pipettieren gründlich mischen. Achten Sie darauf, dass der Schwanz der Maus in der Lösung liegt.
   
   Hinweis: Bei frischen Mäuseschwänzen sind die Extraktionen innerhalb von 30 Minuten nach dem Abschneiden des Schwanzes durchzuführen.
   
   Für tierisches Gewebe: Spülen Sie die Schere oder das Skalpell und die Pinzette vor dem Gebrauch und zwischen verschiedenen Proben in Ethanol 70 %. Legen Sie ein 2-10 mg großes Gewebestück in die Lösung. Durch Vortexen oder Pipettieren gründlich mischen. Stellen Sie sicher, dass sich das Gewebe in der Lösung befindet.
   
   Für Haarschäfte: Spülen Sie die Scheren und Pinzetten vor dem Gebrauch und zwischen verschiedenen Proben mit Ethanol 70 %. Schneiden Sie den überschüssigen Teil des Haarschafts ab und legen Sie die Probe (mit der Wurzel nach unten) in die Lösung. Pro Extraktion wird nur ein Haarschaft mit Wurzel benötigt.
   
   Für Speichel: Pipettieren Sie 10 μl Speichel in die Lösung. Durch Vortexen oder Pipettieren gründlich mischen.
   
   Für auf einer Karte getrockneten Speichel: Pipettieren Sie 50 μl Speichel auf eine Sammelkarte und lassen Sie die Karte trocknen. Spülen Sie die Lochstanze vor der Verwendung und zwischen verschiedenen Proben in Ethanol 70 %. Stanzen Sie eine Scheibe (vorzugsweise 1/8 Zoll oder 3 mm) aus der Karte aus dem Bereich mit der getrockneten Speichelprobe. Legen Sie die Scheibe in die Lösung. Klopfen Sie das Röhrchen oder die Platte auf eine harte Oberfläche, um sicherzustellen, dass sich die Scheibe während der Inkubationszeit in der Lösung befindet.
   
   
3. Die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   
4. Die Proben 3 Minuten bei 95°C inkubieren.
   Hinweis: Das Gewebe wird am Ende der Inkubationszeit nicht vollständig digeriert sein. Das ist normal und beeinträchtigt die Leistung nicht.
   
   
5. 100 μl Neutralisierungslösung B zur Probe geben und durch Vortexen mischen.
   
6. Den neutralisierten Gewebeextrakt bei 4 °C aufbewahren oder sofort in der PCR verwenden. Mit Abschnitt C, Schritt 1 fortfahren.
   Hinweis: Bei langfristiger Lagerung das undigerierte Gewebe entfernen oder die Extrakte in neue Röhrchen oder Wells umfüllen. Die Extrakte können nun bei 4 °C mindestens 6 Monate, in den meisten Fällen ohne nennenswerte Verluste, gelagert werden.
   

Hinweis: Abschnitt C, Schritt 1 - Bei langfristiger Lagerung das undigerierte Gewebe entfernen oder die Extrakte in neue Röhrchen oder Wells übertragen. Die Extrakte können nun bei 4 °C mindestens 6 Monate, in den meisten Fällen ohne nennenswerte Verluste, gelagert werden.

B. DNA-Extraktion bei Wangenabstrichen

1. Bukkalzellen auf einem Stäbchen sammeln und das Stäbchen trocknen lassen. Die Trocknungszeit beträgt etwa 10 bis 15 Minuten.
   Hinweis: Aufgrund des geringen Volumens der für die DNA-Extraktion verwendeten Lösung soll ein Stäbchen mit Schaumstoffspitze verwendet werden. Stäbchen mit Faserspitzen, z. B. aus Baumwolle oder Dacron, sollen vermieden werden, da die Lösung nicht effizient zurückgewonnen werden kann.
   
2. Pipettieren Sie 200 μl der Extraktionslösung in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. 25 μl der Gewebevorbereitungslösung in das Röhrchen geben und zum Mischen auf und ab pipettieren.
   Hinweis: Wenn mehrere Extraktionen durchgeführt werden, können ausreichende Volumen der Extraktions- und Gewebevorbereitungslösungen bis zu 2 Stunden vor der Verwendung im Verhältnis 8:1 vorgemischt werden.
   
3. Legen Sie das getrocknete Stäbchen für den Wangenabstrich in die Lösung und inkubieren Sie dieses bei Raumtemperatur für 1 Minute.
   
4. Drehen Sie das Stäbchen 10 Mal in der Lösung und entfernen Sie dann überschüssige Lösung vom Stäbchen in das Röhrchen, indem Sie das Stäbchen fest gegen die Seite des Röhrchens drehen. Entsorgen Sie das Stäbchen. Das Röhrchen schließen und kurz vortexen.
   
5. Die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   
6. Die Proben 3 Minuten bei 95°C inkubieren.
   
7. 200 μl Neutralisierungslösung B zur Probe geben und durch Vortexen mischen.
   
8. Den neutralisierten Extrakt bei 4 °C aufbewahren oder sofort in der PCR verwenden. Mit Abschnitt C, Schritt 1 fortfahren.
   Hinweis: Die Extrakte können bei 4 °C mindestens 6 Monate gelagert werden, in den meisten Fällen ohne nennenswerte Verluste.
   

C. PCR-Amplifikation

Der REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsmix enthält JumpStart Taq-Antikörper für eine spezifische Hot-Start-Amplifikation. Daher können PCR-Reaktionen bei Raumtemperatur ohne vorzeitige Aktivität der Taq-DNA-Polymerase durchgeführt werden.

Die typische Endkonzentration der Primer beträgt jeweils etwa 0,4 μM. Die optimale Primerkonzentration und die Zyklusparameter sind abhängig vom verwendeten System.

1. Geben Sie die folgenden Reagenzien in ein dünnwandiges PCR-Mikrozentrifugenröhrchen oder eine Platte:

Reagenz	Volumen
Wasser, PCR-Reagenz	x μl
REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsgemisch	10 μl
Vorwärtsprimer	y μl
Rückwärtsprimer	y μl
Gewebeextrakt	4 μl*
GESAMTVOLUMEN	20 μl

Hinweis: Die REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsmischung ist so formuliert, dass die Komponenten in den Extraktions-, Gewebevorbereitungs- und Neutralisierungslösungen kompensiert werden. Wenn dem PCR-Reaktionsvolumen weniger als 4 µl Gewebeextrakt zugesetzt werden, wird eine 50:50-Mischung aus Extraktionslösung:Neutralisierungslösung B verwendet, um das Volumen des Gewebeextrakts auf 4 µl zu erhöhen.

2. Vorsichtig mischen
3. Bei Thermocyclern ohne beheizten Deckel geben Sie 20 µl Mineralöl auf die Mischung in jedem Röhrchen, um eine Verdunstung zu verhindern. Temperaturzyklen durchführen. Die Amplifikationsparameter sollen
4. für die einzelnen Primer, das Template und den Thermocycler optimiert werden.

	Gängige Zyklusparameter
Schritt	Temperatur	Zeit	Zyklen
Anfängliche Denaturierung	94 °C	3 Minuten	1
Denaturierung	94 °C	0,5-1 Minute	30-35
Hybridisierung	45 bis 68 °C	0,5-1 Minute
Erweiterung	72 °C	1-2 Minuten (~ 1 kb/min)
Finale Erweiterung	72 °C	10 Minuten	1
Finaler Halt	4 °C	Unbegrenzter Zeitraum

5. Die amplifizierte DNA kann nach Abschluss der PCR direkt auf ein Agarosegel geladen werden. Es ist nicht notwendig, einen separaten Ladepuffer/Tracking-Farbstoff hinzuzufügen.
Hinweis: PCR-Produkte können, falls gewünscht, für Downstream-Anwendungen wie die Sequenzierung mit dem GenElute^TM PCR-Aufreinigungs-Kit, Katalognummer NA1020, aufgereinigt werden.

Fehlerbehebung

Problem	Ursache	Lösung
Es wird wenig oder kein PCR-Produkt nachgewiesen	Die PCR-Reaktion kann aufgrund von Verunreinigungen im Gewebeextrakt gehemmt werden	Verdünnen Sie das Gewebeextrakt mit einer 50:50-Mischung aus Extraktions- und Neutralisierungslösung. Fügen Sie eine DNA-Kontrolle hinzu und/oder dotieren Sie eine bekannte Template-Menge (100-500 Kopien) zusammen mit dem Gewebeextrakt in die PCR, um auf eine Hemmung zu testen.
	Die Extraktion ist unzureichend	Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten bei 55 °C statt bei Raumtemperatur.
	Eine PCR-Komponente könnte fehlen oder abgebaut sein	Führen Sie eine Positivkontrolle durch, um sicherzustellen, dass die Komponenten funktionieren. Bei der Zusammenstellung der Reaktionen wird darüber hinaus eine Checkliste empfohlen.
	Es werden möglicherweise zu wenige Zyklen durchgeführt	Erhöhen Sie die Anzahl der Zyklen (jeweils 5-10 zusätzliche Zyklen).
	Die Hybridisierungstemperatur kann zu hoch sein	Verringern Sie die Hybridisierungstemperatur in Schritten von 2-4 °C.
	Die Primer sind möglicherweise nicht optimal konzipiert	Überprüfen Sie die Genauigkeit der Sequenzinformationen. Versuchen Sie, den Primer auf 25 bis 30 Nukleotide zu verlängern, wenn die Primer weniger als 22 Nukleotide lang sind. Versuchen Sie, die Primer mit einem GC-Gehalt von 45-60 % neu abzustimmen, wenn der Primer einen GC-Gehalt von weniger als 45 % aufweist.
	Die Denaturierungstemperatur kann zu hoch oder zu niedrig sein	Optimieren Sie die Denaturierungstemperatur durch Erhöhen oder Senken der Temperatur in Schritten von 1 °C.
	Die Denaturierungszeit kann zu lang oder zu kurz sein	Optimieren Sie die Denaturierungszeit, indem Sie diese in 10-Sekunden-Schritten verlängern oder verkürzen.
	Die Erweiterungszeit ist möglicherweise zu kurz	Erhöhen Sie die Erweiterungszeit in Schritten von 1 Minute, insbesondere bei langen Templates.
	Ziel-Template ist schwierig	In den meisten Fällen sind schwierige Ziele auf eine(n) ungewöhnlich hohe(n) GC-Gehalt und/oder Sekundärstruktur zurückzuführen. Es wurde berichtet, dass Betain, Katalognummer B0300, die Amplifikation von Templates mit hohem GC-Gehalt in einer Konzentration von 1,0-1,7 M unterstützt.
Verschiedene Produkte	Der JumpStart Taq-Antikörper funktioniert nicht richtig	Verwenden Sie kein DMSO oder Formamid mit REDExtract-N-Amp™ PCR-Reaktionsgemisch. Es kann mit dem Enzym-Antikörper-Komplex interferieren. Andere Co-Lösungsmittel, gelöste Stoffe (z. B. Salze) und extreme pH-Werte oder andere Reaktionsbedingungen können die Affinität des JumpStart-Antikörpers für die Taq-Polymerase verringern und dadurch seine Wirksamkeit beeinträchtigen.
	Touchdown-PCR kann erforderlich sein	Die "Touchdown"-PCR verbessert die Spezifität vieler PCR-Reaktionen bei verschiedenen Anwendungen erheblich. Bei der Touchdown-PCR wird eine Hybridisierungstemperatur/Polymerisationstemperatur verwendet, die höher als die TM der Primer während der ersten PCR-Zyklen ist. Die Hybridisierungstemperatur/Polymerisationstemperatur wird dann für die verbleibenden PCR-Zyklen auf die Primer-TM reduziert. Die Änderung kann in einem einzigen Schritt oder schrittweise über mehrere Zyklen erfolgen.
Negativkontrolle zeigt ein PCR-Produkt oder ein "falsch positives" Ergebnis	Reagenzien sind kontaminiert	Wir empfehlen, bei jedem PCR-Lauf einen Reagenzienleerwert ohne DNA-Template als Kontrolle zu verwenden, um festzustellen, ob die bei der Extraktion oder PCR verwendeten Reagenzien mit einem Template aus einer früheren Reaktion kontaminiert sind.
Das Gewebe wird nach der Inkubation nicht digeriert.	Es ist nicht zu erwarten, dass das Gewebe vollständig digeriert wird.	Für das REDExtract-N-Amp™ Gewebe-PCR-Kit muss das Gewebe nicht vollständig digeriert werden. Es wird ausreichend DNA für die PCR freigesetzt, ohne dass das Gewebe vollständig digeriert wird.
Das Stäbchen mit Wangenabstrich hat die Lösung vollständig absorbiert	Der empfohlene Stäbchentyp wurde nicht verwendet	Aufgrund des geringen Volumens der für die DNA-Extraktion verwendeten Lösung soll ein Stäbchen mit Schaumstoffspitze verwendet werden. Stäbchen mit Faserspitzen, wie z. B. Baumwolle oder Dacron, sollen vermieden werden, da die Lösung nicht effizient zurückgewonnen werden kann.

Literatur

1. Dieffenbach C, Dveksler G. 1995. PCR Primer: A Laboratory Manual. Katalognummer Z364118. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Don R, Cox PT, Wainwright B, Baker K, Mattick JS. 1991. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008-4008. https://doi.org/10.1093/nar/19.14.4008

3. Erlich HA. 1989. PCR Technology. https://doi.org/10.1007/978-1-349-20235-5

4. Griffin H, Griffin A. 1994. PCR Technology: Current Innovations. Boca Raton: CRC Press.

5. Innis M. 1995. PCR Strategies. Katalognummer Z357499. New York: Academic Press.

6. Innis M. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Katalognummer P8177. San Diego, Kalifornien: Academic Press.

7. M.J M. 1995. PCR 2: A Practical Approach. Katalognummer Z362387. New York: IRL Press.

8. Newton C. 1995. PCR: Essential Data. New York: John Wiley & Sons.

9. Roux KH. 1995. Optimization and troubleshooting in PCR.. Genome Research. 4(5):S185-S194. https://doi.org/10.1101/gr.4.5.s185

10. Erlich HA. 1989. PCR Technology. London: Palgrave Macmillan UK.

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JumpStart und JumpStart-Antikörper sind lizenziert unter U.S.- Patenten Nr. 5,338,671 und 5,587,287 und den entsprechenden Patenten in anderen Ländern.

GenElute, JumpStart und REDExtract-N-Amp sind Marken der Sigma-Aldrich Co. LLC.
REDTaq ist eine eingetragene Marke der Sigma-Aldrich Co. LLC.