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Verbrückte Nukleinsäure

Verbrückte Nukleinsäure ist ein neues Nukleinsäureanalogon, das eine 2'-O, 4'-C-Methylenbrücke enthält (Abbildung 1). Diese Brücke - in der 3'-endo-Konformation geschlossen - schränkt die Flexibilität des Ribofuranoserings ein und verschließt die Struktur in einer starren bicyclischen Formation. Dies führt zu einer verbesserten Leistung des Assays und einer größeren Bandbreite an Anwendungen. 

Verbrückte Nukleinsäure und DNA-Monomere im nativen Zustand

Abbildung 1.Struktur verbrückter Nukleinsäure und DNA-Monomere im nativen Zustand.

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Verbrückte Nukleinsäure in PCR-Primern, qPCR-Sonden und anderen Arten von Oligonukleotiden ist in Wasser und Standardpuffern löslich und folgt den Watson-Crick-Basenpaarungsregeln.1

Vorteile

Wenn sie in Oligonukleotide eingebaut wird, bietet verbrückte Nukleinsäure mehrere Vorteile im Vergleich zu DNA-Basen im nativen Zustand:

  • Erhöhte thermische Stabilität und Hybridisierungsspezifität
  • Genauere Genquantifizierung und allelische Diskriminierung
  • Einfachere und flexiblere Designs für problematische Zielsequenzen

Erhöhte thermische Stabilität und Hybridisierungsspezifität

Der Einbau von verbrückter Nukleinsäure in Oligonukleotide erhöht die thermische Duplex-Stabilität2 und verbessert die Spezifität der Oligonukleotid-Hybridisierung an die Zielsequenzen.3 Im Fall der qPCR wird hierdurch die Hintergrundfluoreszenz durch unerwünschte Bindungen reduziert und damit das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Darüber hinaus kann die verbesserte Hybridisierung des PCR-Primers oder der qPCR-Sonde die Schmelztemperatur (Tm) unter mittleren Salzbedingungen um bis zu 8 °C pro Monomer-Substitution verbrückter Nukleinsäure im Vergleich zu DNA-Oligonukleotiden im nativen Zustand erhöhen4 (Tabelle 1). Diese Zunahme der Hybridisierung führt zu einer erheblichen Ausweitung der Assay-Bedingungen und ermöglicht ein erfolgreicheres Multiplexing.5

Tabelle 1Erhöhung der Anzahl der Basen verbrückter Nukleinsäuren in einem Oligonukleotid erhöht die Tm.

* Tm des Duplex zwischen einem Oligonukleotid und seiner komplementären Sequenz.
Durch die fettgedruckten Buchstaben in den Sequenzen werden Basen verbrückter Nukleinsäuren bezeichnet.

Genauere Genquantifizierung und allelische Diskriminierung

Die Fähigkeit von Oligonukleotiden, zwischen Allelen über SNP zu unterscheiden, wird durch den Einbau von Basen verbrückter Nukleinsäure6-8 (Abbildung 2) erheblich verbessert. Das Vorhandensein einer einzelnen Basenfehlpaarung hat eine größere destabilisierende Wirkung auf die Duplexbildung zwischen einem Oligonukleotid mit verbrückter Nukleinsäure und seinem Ziel als bei einem DNA-Oligonukleotid im nativen Zustand. Kürzere Oligonukleotide, die Basen verbrückter Nukleinsäuren enthalten, können bei den gleichen Temperaturen verwendet werden wie längere DNA-Oligonukleotide im nativen Zustand.

LNA doppelt markierte Sonden unterscheiden in der SNP-Genotypisierungsanalyse besser als DNA doppelt markierte Sonden

Abbildung 2.Doppelt markierte Sonden verbrückter Nukleinsäuren unterscheiden in der SNP-Genotypisierungsanalyse besser als doppelt markierte DNA-Sonden9. Pink) Mutanten-DNA-Analyse mit Mutantensonde verbrückter Nukleinsäure (16mer mit 3 Basen verbrückter Nukleinsäure). Grün) Mutanten-DNA-Analyse mit DNA-Mutantensonde (25mer) im nativen Zustand. Rot) Wildtyp-DNA mit DNA-Mutantensonde im nativen Zustand (25mer). Violett) Wildtyp-DNA mit Mutantensonde verbrückter Nukleinsäure (16mer mit 3 Basen verbrückter Nukleinsäure).

Leichtere und flexiblere Designs für problematische Zielsequenzen

Aufgrund der verbesserten Hybridisierungseigenschaften von verbrückter Nukleinsäure bei gleichzeitiger Erhöhung der Tm können Oligonukleotide mit verbrückter Nukleinsäure kürzer synthetisiert werden, wodurch bestimmte Designbeschränkungen, die bei DNA-Oligonukleotiden im nativen Zustand auftreten, überwunden werden. Insbesondere können Oligonukleotide mit verbrückter Nukleinsäure für traditionell problematische Zielsequenzen, wie AT- oder GC-reiche Regionen, entwickelt werden. So müssen AT-reiche DNA-Oligonukleotide im nativen Zustand oft über 30 Basen lang sein (manchmal sogar über 40 Basen), um den Richtlinien für das Design von Amplikons zu entsprechen, können aber trotzdem schlecht funktionieren. Bei Oligonukleotiden mit verbrückter Nukleinsäure ermöglicht die selektive Platzierung von Basen verbrückter Nukleinsäure das optimale Design hochspezifischer, kürzerer Oligonukleotide, die auch bei Längen von nur 13 bis 20 Basen gut funktionieren. Auch das Design von Oligonukleotiden mit schwierigen SNP als Ziel, wie z. B. die relativ stabile G:T-Fehlpaarung, wird durch verbrückte Nukleinsäure erheblich vereinfacht. 

Weiterer Vorteil

PCR-Primer und qPCR-Sonden verbrückter Nukleinsäure sind mit allen Echtzeit-Thermocyclern und Geräten für den analytischen Endpunktnachweis kompatibel. Es sind keine speziellen Geräte erforderlich.

Anwendungen

Verbrückte Nukleinsäure kann in alle verfügbaren qPCR-Nachweischemikalien integriert werden, darunter:

  • SYBR® Green-Primer
  • Doppelt markierte Sonden
  • Molecular Beacons
  • LightCycler® Sonden
  • Scorpions® Sonden

Sie bietet in den folgenden Bereichen Vorteile:

  • SNP-Nachweis
  • Allelische Diskriminierung
  • Pathogennachweis
  • Multiplexing
  • Quantifizierung der Viruslast
  • Genexpressionsanalyse
  • Bestimmung der Genkopien

Sie kann auch in diesen Sequenzen verwendet werden:

  • Antisense-Oligonukleotide
  • Decoy-Oligonukleotide
  • Aufnahmesonden
  • Aptamere
  • Ribozyme
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Literatur

1.
Egli M, Teplova M, Minasov G, Kumar R, Wengel J. 2001. X-ray crystal structure of a locked nucleic acid (LNA) duplex composed of a palindromic 10-mer DNA strand containing one LNA thymine monomer. Chem. Commun..(7):651-652. https://doi.org/10.1039/b009447l
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