Protokoll zur Konjugation von NHS-Estermodifikationen an Amino-markierte Oligonukleotide

Dieses Protokoll dient der Konjugation von NHS-Estermodifikationen, wie z. B. TxRd (Sulforhodamin 101-X) (das Protokoll ist für die meisten NHS-Estermodifikationen geeignet) an ein Oligonukleotid mit einer Aminomarkierung, wie 5'-Amino-Modifier C6 (Abbildung 1). Da TxRd (Sulforhodamin 101-X) und mehrere andere Modifikationen nur als NHS-Ester verfügbar sind, müssen sie in einer separaten Reaktion nach der Synthese manuell an Amino-markierte Oligonukleotide konjugiert werden.

Abbildung 1. Beispiel einer NHS-Ester-Modifikationsreaktion nach der Synthese mit TxRd (Sulforhodamin 101-X) und einem 5'-Amino-Modifier C6-Oligonukleotid.

Definitionen/Abkürzungen

• DMSO - Dimethylsulfoxid
• EtOH - Ethanol
• HCl - Salzsäure
• NaCl - Natriumchlorid
• NaB - Natriumtetraborat-Decahydrat (Na₂B₄O_{7 ּ}· 10H₂O)

Ausrüstung

• Laborschüttler
• Gekühlte Zentrifuge (Eppendorf™ 5810R oder äquivalent)
• Lyophilisator oder Zentrifugalverdampfer (für luftlose Trocknung)

Materialien

• 1 ml-Spritze
• Injektionsnadel, Größe in Gauge: 20
• 2 ml-Zentrifugenröhrchen
• 50 ml-Zentrifugenröhrchen (optional)
• Pipettenspitzen
• Einwegpipetten
• NaB (Produkt-Nr. S9640)
• Milli-Q^® H₂O
• HCl (konzentriert)
• 100% EtOH (Produkt-Nr. E7023-4L) bei –70 °C
• 70% EtOH bei –20 °C
• 3M Natriumacetat-Puffer (Produkt-Nr. S7899-1L)
• NHS-Estermodifikation der Wahl
• 5'-Amino-Modifier C6-Oligonukleotid mit kundenspezifischer Sequenz

Methode

Der Konjugationsprozess ist in zwei Hauptschritte aufgeteilt: 1) die Konjugationsreaktion und 2) die Entfernung der überschüssigen, freien NHS-Ester-Modifikation durch Ausfällung nach der Konjugation.

Obwohl HPLC die herkömmliche Methode zur Entfernung überschüssiger, freier NHS-Ester-Modifikationen und ungekoppelter Oligonukleotide ist, können auch andere Aufreinigungsverfahren, wie z. B. Ausfällung, wirksam sein. Durch Ausfällung (siehe unten) werden die meisten, aber nicht alle verbleibenden NHS-Ester-Modifikationen entfernt. Je nach Anwendung kann die nicht konjugierte Modifikation ein Problem darstellen. Sie reagiert zwar nicht weiter, da der NHS-Ester durch den Puffer hydrolysiert wird, kann aber zum Hintergrundrauschen beitragen und daher zu einem schlechten S:N-Verhältnis führen (wenn es sich bei der Modifikation um einen Farbstoff handelt, wie z. B. TxRd (Sulforhodamin 101-X)) oder die Oberflächenbeladungsdichte verringern (wenn die Modifikation zur Anlagerung dient, z. B. Biotin). Außerdem verbleibt ein ungekoppeltes Oligonukleotid.

Konjugationsreaktion

Beginnen Sie mit den empfohlenen Bedingungen und optimieren diese nach Bedarf. 

1. Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor der Verwendung aufgetaut, gründlich gemischt und zentrifugiert werden.  
2. Lösen Sie das Amino-markierte Oligonukleotid in einem Konjugationspuffer, wie z. B. NaB pH-Wert 8,5, gemäß den Richtlinien in Tabelle 1 auf. Die endgültige Oligonukleotidkonzentration liegt zwischen 0,3 und 0,8 mM. Siehe Zusätzliche Hinweise für die Vorbereitung von 50 ml 0,091 M NaB-Puffer.
3. Lösen Sie die NHS-Estermodifikation in DMSO auf. Die Konzentration der NHS-Ester-Modifikation beträgt etwa 14 mM (kann aufgrund des variablen Molekulargewichts der Modifikation abweichen). Siehe Zusätzliche Hinweise für die Herstellung von NHS-Ester-Modifikationen.
4. Geben Sie das empfohlene Volumen der NHS-Ester-Modifikation zum empfohlenen Volumen des aminomarkierten Oligonukleotids gemäß den Vorgaben in Tabelle 1. Vortexen Sie das Röhrchen leicht. Die angegebenen Volumen passen in ein 2 ml-Röhrchen. Für größere Reaktionen können entweder mehrere 2 ml-Röhrchen oder ein 50 ml-Röhrchen verwendet werden.
5. Das/die Röhrchen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) schütteln. Stellen Sie die Schüttelgeschwindigkeit entsprechend ein, um Spritzer an der Gefäßwand zu vermeiden. Decken Sie das/die Röhrchen mit Aluminiumfolie ab, um die Farbstoffe vor Photobleiche zu schützen.

Tabelle 1 Referenzleitfaden für die Konjugation.

Menge Amino-markierte Oligonukleotide	Volumen NaB-Konjugationspuffer	Lösungsvolumen NHS-Ester-Modifikation	EtOH/Natriumacetat-Volumen für die Fällung
< 30 OD	200 µl	50 µl	1 ml
> 30 bis 60 OD	600 µl	100 µl	2 ml

Ausfällung nach der Konjugation

Die Ausfällung nach der Konjugation erfolgt in einem 2 ml-Röhrchen (50 ml-Röhrchen für einen größeren Reaktionsmaßstab). Achten Sie darauf, die Farbstoffe vor Photobleichung zu schützen.

1. Das Volumen der EtOH/3M-Natriumacetat-Lösung (9:1 V/V) wird gemäß den Vorgaben in Tabelle 1 zum Konjugations-Reaktionsvolumen hinzugefügt. Vortexen Sie die Lösung, um die Ausfällung einzuleiten. Die EtOH / 3M-Natriumacetat-Lösung soll frisch (eine Woche haltbar) mit EtOH absolut hergestellt werden.
2. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 20 Minuten bei 4 °C. Verwenden Sie eine Zentrifuge des Typs Eppendorf 5810R bei 3.000 U/min oder eine Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min.
3. Verwenden Sie eine Einwegpipette, um den Überstand zu entfernen. Achten Sie darauf, dass sich das Plätzchen nicht vom Boden des Röhrchens löst.
4. 500 µl kaltes 70% EtOH (-20 °C) zugeben und vorsichtig um den Boden des Röhrchens schwenken. Nicht vortexen (das Plätzchen soll ungestört bleiben).
5. 20 Minuten lang bei 4 °C mit der in Schritt 2 eingestellten Drehzahl zentrifugieren.
6. Verwenden Sie eine Einwegpipette, um den Überstand zu entfernen.
7. Falls gewünscht, führen Sie einen zweiten EtOH-Waschschritt durch (Schritte 4-6).
8. Trocknen durch Luft, Lyophilisierung oder Zentrifugalverdampfung.

Das Oligonukleotid ist nun mit der Modifikation konjugiert und kann für die beabsichtigte Anwendung in Wasser oder Puffer gelöst werden.

Zusätzliche Hinweise

Herstellung von 50 ml 0.091 M NaB-Puffer

1. 1,735 g NaB in ca. 45 ml Milli-Q H₂O auflösen.
2. Lösen Sie das Pulver vollständig auf, bevor Sie den pH-Wert mit HCl auf 8,5 einstellen. Den pH-Wert durch Zugabe von HCl in 50 μl-Portionen senken. Die Lösung gründlich vortexen und dann etwa 25 μl auf ein pH-Stäbchen pipettieren. Tauchen Sie das pH-Stäbchen nicht direkt in die Lösung.
3. Die Lösung mit Milli-Q H₂O auf 50 ml auffüllen. Die Lösung erneut vortexen.
4. Aliquotieren Sie 1 ml der Lösung in 2 ml-Röhrchen, bis die Lösung aufgebraucht ist. Lagern Sie die Röhrchen bei -20 °C, um die pH-Veränderung zu minimieren.

NaB kann durch andere aminfreie Puffer ersetzt werden, solange der pH-Wert nicht höher als 8,5 ist (ein höherer pH-Wert würde den NHS-Ester zu schnell hydrolysieren).

Herstellung von NHS-Estermodifikationen

NHS-Estermodifikationen werden als wasserfreie Reagenzien in Flaschen mit luftdicht verschlossenem Deckel geliefert. Halten Sie Feuchtigkeit von NHS-Estern fern, bevor Sie diese der Pufferlösung für aminomarkierte Oligonukleotide hinzufügen, da sie schnell hydrolysieren. Verwenden Sie wasserfreies DMSO oder ein anderes Lösungsmittel.  

1. Eine NHS-Estermodifikation soll bei -20 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass sie vor dem Öffnen der Flasche bei Raumtemperatur vollständig aufgetaut ist (keine Wärme verwenden).
2. Befestigen Sie eine 20-Gauge-Nadel an der Spitze einer 1 ml-Spritze. Verwenden Sie diese Spritze, um die gewünschte Menge DMSO zu extrahieren (verwenden Sie 100 µl pro mg NHS-Ester-Modifikationsfeststoff; je nach Modifikation kann zusätzliches DMSO erforderlich sein). Verwenden Sie die "Ballon"-Technik, um die DMSO-Vorratsflasche unter Stickstoffdruck zu halten und dadurch Feuchtigkeitsbildung zu vermeiden.
3. Geben Sie das wasserfreie DMSO in die Flasche mit der NHS-Estermodifikation. Lösen Sie das Pulver durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren des DMSO auf, während Sie die Seiten des Fläschchens abwaschen. Vortexen Sie die Flasche vorsichtig, um eine vollständige Auflösung zu gewährleisten.
4. Verwenden Sie die Modifikation sofort (eine Lagerung wird nicht empfohlen).