Protokoll zur Hybridisierung von Oligonukleotiden

• Abkürzungen
• Ausrüstung und Zubehör für die DNA-/RNA-Hybridisierung
• DNA-/RNA-Hybridisierungsmethode
• Pufferrezepte für die DNA-Hybridisierung

Bei diesem Protokoll werden zwei einzelsträngige Oligonukleotide mit komplementären Sequenzen hybridisiert (Abbildung 1). Das Erhitzen und anschließende Abkühlen erleichtert die Hybridisierung.

Abbildung 1. Beispiel einer Hybridisierungsreaktion. Durch Hitze werden alle Wasserstoffbrückenbindungen 'gebrochen', wodurch die Sekundärstruktur in jedem Oligonukleotid zerstört wird. Langsames Abkühlen erleichtert dann die Hybridisierung, da sich neue Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Sequenzen bilden.

Definitionen/Abkürzungen

EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure

NaCl: Natriumchlorid

Trizma^® Base: Markenname für Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethan]

Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid oder Oligomer. Oligonukleotide sind kurze, einzelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die hybridisiert (erhitzt oder geschmolzen) werden müssen, damit sie sich mit einem entsprechenden komplementären DNA- oder RNA-Strang zu einem Doppelstrang verbinden können.

DNA-Hybridisierung: Auf dieser Seite wird der Hybridisierungsprozess für alle Oligonukleotide beschrieben. In einigen Fällen wird die Hybridisierung als DNA-Hybridisierung bezeichnet, obwohl das Verfahren auch für RNA verwendet wird. Als Hybridisierung wird das Erhitzen und Abkühlen zweier einzelsträngiger Oligonukleotide mit komplementären Sequenzen bezeichnet. Durch Hitze werden alle Wasserstoffbrückenbindungen gebrochen und durch Abkühlung können sich neue Bindungen zwischen den Sequenzen bilden.

Ausrüstung und Zubehör für die DNA-/RNA-Hybridisierung

• Wärmeblock oder Thermocycler
• 2 ml-Zentrifugenröhrchen
• Pipettenspitzen
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA (Produkt-Nr. E9884)
• NaCl (Produkt-Nr. S3014)
• Trizma^® Base (Produkt-Nr. 93362)
• Zwei einzelsträngige Oligonukleotide mit komplementären Sequenzen

DNA-/RNA-Hybridisierungsmethode

Der Hybridisierungsprozess ist in zwei Hauptschritte gegliedert: 1) Auflösen und 2) Hybridisieren, entweder durch einen Wärmeblock oder einen Thermocycler.

Auflösen des Oligos

Obwohl jedes Oligonukleotid in einer abgemessenen Menge geliefert wird, ist es wichtig, diese mit einem Spektralphotometer zu überprüfen, um beste Ergebnisse zu erhalten und sicherzustellen, dass der Reaktion gleiche Mengen jedes Oligonukleotids zugesetzt werden.

• Lösen Sie jedes Oligonukleotid in einem Volumen des Hybridisierungspuffers (siehe nachstehende Pufferrezepte), sodass alle die gleiche Konzentration haben.
• Die Konzentration jedes Oligonukleotids muss 2X der gewünschten Konzentration des Duplex-Oligonukleotids betragen.

Beispiel

Die gewünschte Konzentration des Duplex-Oligonukleotids beträgt 50 µM.

1. Oligonukleotid 1: geliefert mit 10,55 OD (312,6 µg, 49,9 nmol); die gemessene OD-Menge mit dem Spektralphotometer überprüfen.
2. Oligonukleotid 2: geliefert mit 9,04 OD (279,7 µg, 45,9 nmol); die gemessene OD-Menge mit dem Spektralphotometer überprüfen.
3. Jede Oligonukleotid-Stammlösung muss 2X der gewünschten Duplex-Oligonukleotidkonzentration betragen, d. h. jede Stammlösung muss 100 µM betragen.
   1. Für Oligonukleotid 1 werden 49,9 x 10 = 499 µl Hybridisierungspuffer hinzugefügt, um eine 100 µM-Stammlösung herzustellen.
   2. Für Oligonukleotid 2 werden 45,9 x 10 = 459 µl Hybridisierungspuffer hinzugefügt, um eine 100 µM-Stammlösung herzustellen.

*Diese Berechnung ist eine Kurzversion, die ausschließlich für die Erstellung von 100-µM-Lösungen funktioniert und hier nur als Beispiel verwendet wird. Weitere Informationen zur Berechnung verschiedener Oligonukleotidkonzentrationen finden Sie in den Leitlinien zu Handhabung & Stabilität.

Hybridisierung von Oligos

Wärmeblock

1. Mischen Sie gleiche Volumina der äquimolaren Oligonukleotide in einem Mikroröhrchen.
2. Inkubieren Sie das Mikroröhrchen 5 Minuten bei 95 °C.
3. Lassen Sie das Mikroröhrchen langsam auf Raumtemperatur abkühlen (< 60 min).

Thermocycler

Auch wenn ein Wärmeblock funktioniert, ermöglicht ein Thermocycler einen konstanteren Prozess.

1. Mischen Sie gleiche Volumen der äquimolaren Oligonukleotide in einem PCR-Röhrchen.
2. Verwenden Sie das nachstehende Wärmeprofil:
   1. Auf 95 °C erhitzen und die Temperatur 2 Minuten lang halten.
      
   2. 45 Minuten lang auf 25 °C abkühlen.
      
   3. Zur vorübergehenden Lagerung auf 4 °C abkühlen.
3. Zentrifugieren Sie das PCR-Röhrchen kurz, um die gesamte Feuchtigkeit aus dem Deckel zu entfernen.

Nach dem Einsatz des Wärmeblocks oder des Thermocyclers ist das Duplex-Oligonukleotid einsatzbereit oder kann gelagert werden. Weitere Informationen zur Lagerung von Oligonukleotiden finden Sie in den Leitlinien zu Handhabung und Stabilität.

Pufferrezepte für die DNA-Hybridisierung

Herstellung aller Puffer mit Milli-Q^® Wasser.

Zusammensetzung der Hybridisierungspuffer (1X)

• 10 mM Tris, pH 7,5 - 8,0
• 50 mM NaCl
• 1 mM EDTA

Ligase-Pufferzusammensetzung (1X)

Dieser Puffer wird in der Regel mit T4-DNA-Ligase verwendet.

• 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
• 10 mM MgCl₂
• 1 mM ATP
• 10 mM DTT

Kinase-Pufferzusammensetzung (1X)

Dieser Puffer wird in der Regel mit T4-Polynukleotidkinase verwendet.

• 70 mM Tris-HCl, pH 7,6
• 10 mM MgCl₂
• 5 mM DTT