Taq-DNA-Polymerase und PCR-Kits von Kapa Biosystems

Taq-DNA-Polymerase PCR-Reagenzien und -Kits für die DNA-Extraktion und -Amplifikation

DNA-Extraktion und -Amplifikation sind kritische Schritte im molekularbiologischen Arbeitsablauf und erfordern oft aufgereinigte, hochwertige DNA. Kapa Biosystems bietet ein robustes Portfolio an DNA-Polymerase-Reagenzien und PCR-Kits für die Extraktion und Amplifikation einer Vielzahl genetischer Materialien von Säugern und Pflanzen an. Unsere Reagenzien und Kits von Kapa Biosystems enthalten herausragende thermostabile Polymerasen und sind so konzipiert, dass sie Ihre nächste Entdeckung mit verbesserter Empfindlichkeit und Spezifität für verschiedene Anwendungen ermöglichen.

• KAPA Taq-DNA-Polymerase
• KAPA2G Fast Multiplex
• KAPA2G Robust DNA-Polymerase
• KAPA Long Range PCR-System
• KAPA Maus-Genotypisierung
• KAPA Express Extract
• KAPA3G Pflanzen-PCR-Kits

KAPA Taq-DNA-Polymerase

Hohe Qualität und Leistung für die Routine-PCR.

KAPA Taq-DNA-Polymerase basiert auf der Einzeluntereinheit, der Wildtyp-Taq-DNA-Polymerase des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus. KAPA Taq- und KAPA Taq HotStart-DNA-Polymerase verfügen über 5'-3'-Polymerase- und 5'-3'-Exonuklease-Aktivitäten, aber keine 3'-5'-Exonuklease-Korrekturleseaktivität. Das Enzym hat eine Fehlerquote von etwa 1 Fehler pro 2,2 x 10⁵ Nukleotide integriert.

KAPA Taq-DNA-Polymerasekits sind ideal geeignet für:

• Standard-PCR
• DNA-Markierung
• DNA-Sequenzierung
• Zahlreiche Anwendungen, für die eine hochwertige, thermostabile DNA-Polymerase benötigt wird

Zu den Vorteilen gehören:

• Verbesserte Empfindlichkeit, Spezifität und Ausbeute
• Eine neuartige Pufferformulierung erleichtert spezifische Hybridisierung (Annealing) der Primer, woraus eine höhere Ausbeute eines spezifischen Produkts resultiert

Abbildung 1. Ein 500 bp-Fragment des CCR5-Gens wurde unter Verwendung von 100 ng, 10 ng, 1 ng oder 100 pg humaner genomischer DNA als Template amplifiziert. KAPA Taq HotStart weist im Vergleich zu HotStart-Produkten von Mitbewerbern eine verbesserte Empfindlichkeit, Spezifität und Ausbeute auf. Alle Reaktionen wurden nach den vom Hersteller empfohlenen Methoden durchgeführt.

Abbildung 2. Ein 270 bp-Amplikon wurde mit KAPA-Taq oder KAPA-Taq-HotStart aus Mykoplasmen-DNA amplifiziert. Die Empfindlichkeit wurde mit einer 10X Template-Verdünnungsreihe, beginnend mit 1 ng DNA, getestet.

KAPA2G FAST MULTIPLEX

Hochgeschwindigkeits- und Hochleistungs-Multiplex-PCR.

KAPA2G Fast Multiplex PCR-Kits enthalten ein Enzym der zweiten Generation (2G), das durch einen gerichteten Evolutionsprozess erhalten wurde. KAPA2G FAST HotStart-DNA-Polymerase ist eine Antikörper-vermittelte Hot-Start-Formulierung, die auf höhere Prozessivität und Geschwindigkeit ausgerichtet ist und ein deutlich schnelleres Erreichen der Erweiterungsraten als Wildtyp-Taq-DNA-Polymerase bietet. KAPA2G Fast ist nicht nur schnell, sondern bietet auch eine höhere Ausbeute und Empfindlichkeit als die Enzyme der Mitbewerber für hochmultiplexe PCR.*

KAPA2G FAST Multiplex bietet:

• Einheitliche Repräsentation aller Amplikons
• Erfolgreiche Multiplex-PCR mit schwierigen, GC-reichen Targets
• Reduzierung der PCR-Zykluszeit um bis zu 60 %
• Erweiterungszeiten von nur 15 Sekunden
• Hohe Geschwindigkeit ohne Leistungseinbußen
• Minimale Optimierung bei der Formulierung von Mastermixen

Abbildung 3. *Multiplex-PCR (8-Plex), durchgeführt mit dem KAPA2G Fast Multiplex-PCR-Kit, Competitor Q und Competitor I. Die Reaktionen (25 μl) enthielten 1X PCR Master Mix (KAPA und Competitor Q) oder 1X PCR-Puffer, 3 mM MgCl2, 0,2 mM jedes dNTP und 1 U hot start Taq-DNA-Polymerase (inhouse hergestellte Multiplex-Reagenzien, mit Competitor I). Als Template wurde humane genomische DNA verwendet (250 - 2 ng pro Reaktion), und die Primer wurden mit jeweils 0,2 μM geliefert. Die Zyklen wurden entsprechend den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt (30 Zyklen).

Abbildung 4. *Multiplex-PCR (12-Plex), durchgeführt mit dem KAPA2G Fast Multiplex PCR-Kit, Competitor Q und Competitor I. Eine einheitliche Repräsentation aller Amplikons in einem komplexen Multiplex-Assay zu erreichen, ist aufgrund von Amplifikationsverzerrungen eine Herausforderung - aufgrund von Unterschieden in der Amplikonlänge, Sekundärstruktur und Priming-Effizienz. Die Reaktionen (25 μl) enthielten 1X PCR Master Mix (KAPA und Competitor Q) oder 1X PCR-Puffer, 3 mM MgCl2, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 U Hot-Start Taq-DNA-Polymerase (inhouse hergestellte Multiplex-Reagenzien, mit Competitor I). Als Template wurde humane genomische DNA verwendet (250 - 2 ng pro Reaktion), und die Primer wurden mit jeweils 0,2 μM geliefert. Die Zyklen wurden entsprechend den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt (30 Zyklen).

Abbildung 5. Schnelle Multiplex-PCR mit KAPA2G Fast Multiplex PCR-Kits. Multiplex-PCR mit Wildtyp-Taq erfordert in der Regel lange Hybridisierungs- und Erweiterungszeiten, damit alle Primer im Multiplex hybridisiert und verlängert werden können. Die Gesamt-PCR-Zykluszeiten, die für 4-Plex-, 8-Plex- und 12-Plex-Multiplex-PCR (30 Zyklen, Einrichtung gemäß den Empfehlungen der Hersteller) mit den KAPA2G Fast Multiplex PCR-Kits und dem Competitor Q Multiplex-PCR-Kit (das Wildtyp-Taq-DNA-Polymerase enthält) erforderlich sind, sind angegeben. Mit dem KAPA2G Fast Multiplex-PCR-Kit sind Zeiteinsparungen von 40 - 60 % möglich.

Abbildung 6. GC-reiche Multiplex-PCR (6-Plex), durchgeführt mit dem KAPA2G Fast Multiplex PCR-Kit, Competitor Q und Competitor I. Erfolgreiche Multiplex-PCR mit Wildtyp-Taq ist auf leichte, einfache Ziele beschränkt, die mit gleicher Effizienz amplifiziert werden können. Die verbesserte Prozessivität der weiterentwickelten KAPA2G Fast DNA-Polymerase ermöglicht eine einheitliche Multiplex-PCR für ein breites Spektrum schwieriger Ziele. Die Reaktionen (25 μl) enthielten 1X PCR Master Mix (KAPA und Competitor Q) oder 1X PCR-Puffer, 3 mM MgCl2, 0,2 mM von jedem dNTP und 1 U Hot-Start Taq-DNA-Polymerase (inhouse hergestellte Multiplex-Reagenzien, mit Competitor I). Als Template wurde humane genomische DNA verwendet (250 - 2 ng pro Reaktion), und die Primer wurden mit jeweils 0,2 μM geliefert. Zu allen Reaktionen wurde DMSO (5%) und KAPA-Verstärker 1 (1X) hinzugefügt. Die Zyklen wurden entsprechend den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt (30 Zyklen). Die Amplikons haben eine Größe von 241 - 642 bp und einen GC-Gehalt von 72,7 - 83,8 %.

KAPA2G ROBUST DNA-POLYMERASE

Die KAPA2G Robust DNA-Polymerase wurde entwickelt, um inkonsistente Amplifikationen in einem breiten Spektrum von Amplikontypen (GC- und AT-reich) zu beseitigen. Dieses Produkt ermöglicht eine höhere Prozessivität und spezifische Aktivität, was sich in einer robusten PCR-Leistung, hoher Empfindlichkeit und verbesserter Toleranz gegenüber gängigen Inhibitoren niederschlägt. Dieses leistungsstarke Kit ist ideal für anspruchsvolle PCR-Anwendungen und schwierige Proben geeignet, da es die Optimierung mit mehreren Enzymen und Protokollen überflüssig macht.

KAPA2G Robust DNA-Polymerase bietet:

• Anwendungen, die eine höhere Ausbeute pro Enzymeinheit erfordern
• Kolonie-PCR
• Toleranz gegenüber der Verschleppung von Inhibitoren und Rohproben-PCR (z. B. FFPE)
• Routine-PCR unter Verwendung der HotStart- oder Readymix-Formulierung

Effiziente Amplifikation von GC- und AT-reichen Targets:

• Robuste Leistung in einem breiten Spektrum von GC- und AT-reichen Templates
• Erhöhte PCR-Erfolgsraten

Abbildung 7. Jeweils die Hälfte der mit 72 der 96 in dieser Studie verwendeten Primersätze erzeugten PCR-Produkte wurden in einem 1 % TBE-Agarose-Gel elektrophoretisiert. Die Amplikons wurden in der Reihenfolge des zunehmenden GC-Gehalts geladen, wobei sich der niedrigste GC-Gehalt (27 %, blau) oben links und der höchste GC-Gehalt (84 %, rot) unten rechts auf jeder Composite-Gel-Abbildung befindet. Die für diese Studie ausgewählten Primer hatten unterschiedliche Primerlängen, Sequenzzusammensetzungen, theoretische Schmelztemperaturen und andere Designmerkmale. Einige Primer enthielten 5'-Schwänze für die Post-PCR-Sequenzierung mit M13 oder anderen Standard-Sequenzierungsprimern. A. KAPA2G Robust HotStart ReadyMix-Reaktionen (25 μl) wurden wie in der Bedienungsanleitung beschrieben durchgeführt. B. Wildtyp-Taq-Reaktionen (25 μl, mit 0,5 U Taq pro Reaktion) wurden in Taq-Reaktionspuffer (1,5 mM MgCl2 bei 1X) unter Verwendung der gleichen finalen Primer- und dNTP-Konzentrationen wie für KAPA2G Robust durchgeführt.

Alle Reaktionen enthielten 25 ng humane genomische DNA. 5% DMSO war in allen Reaktionen (KAPA2G Robust und Taq) enthalten, die auf Amplikons mit einem GC-Gehalt von > 70 % abzielten.

Verbesserte Toleranz gegenüber gängigen PCR-Inhibitoren

• Effiziente Amplifikation aus Rohproben
• Höhere Ausbeute und Empfindlichkeit pro Enzymeinheit

Abbildung 8. Amplifikation eines 1,5 kb-Fragments aus 1 pg Plasmid-DNA in Gegenwart von vier gängigen PCR-Inhibitoren unter Verwendung des KAPA2G Robust HotStart PCR-Kits und Wildtyp-Hot-Start-Taq-Polymerase. Alle Reaktionen enthielten 0,5 Einheiten des Enzyms pro 25 μl Reaktion. Es wurde durchgängig KAPA2G Robust HotStart-Puffer B verwendet, wobei für Reaktionen, die SDS enthalten, KAPAEnhancer 1 hinzugefügt wurde. Die Zyklisierung erfolgte mit einem Eppendorf Mastercycler epgradient S unter Verwendung eines Standard 3-Schritt-Zyklusprofils (35 Zyklen) mit einer Hybridisierungstemperatur von 64 ºC und 1,5 min Erweiterungszeit pro Zyklus für alle Enzyme.

Unerreichte Leistung in der Kolonie-PCR

• Höhere Ausbeuten und verbesserte Konsistenz der PCR direkt aus E. coli und Hefezellen.

Abbildung 9. Amplifikation eines klonierten 2,7 kb-Inserts aus vier häufig verwendeten E. coli-Stämmen (DH5a, DH10B, JM109 oder BL21) unter Verwendung von KAPA2G Robust HotStart (oben) oder Wildtyp-Taq (unten). Die Kolonien (gewachsen auf LB-Agar + Amp-Platten) wurden entweder direkt in einzelnen PCR-Reaktionen resuspendiert (links) oder zunächst in Wasser in PCR-Qualität resuspendiert und dann zu PCR-Reaktionsmischungen (Mitte) hinzugefügt. Bei Übernachtkulturen (hergestellt in LB + Amp) wurde 1 μl direkt zur PCR-Mischung (rechts) gegeben.

Abbildung 10. Amplifikation eines 2,5 kb (links) bzw. 1,6 kb (rechts) Fragments des GSH1-Gens aus drei häufig verwendeten S. cerevisiae-Stämmen (BY4742, FY23 und W303) unter Verwendung von KAPA2G Robust HotStart (oben) bzw. Wildtyp-Taq (unten). Kolonien (von YPD-Agarplatten) oder YPD-Übernachtkulturen wurden zunächst in 50 μl Volumen mit NaOH oder Zymolase (wie angegeben) lysiert.

KAPA LONG RANGE PCR-SYSTEM

Das KAPA Long Range PCR-System ist eine Mischung aus Taq-DNA-Polymerase und einer archaealen (B-Familie) DNA-Polymerase mit Korrekturlesefunktion. Dieses Zwei-Enzym-System wurde speziell für die Unterstützung der Distanz-PCR und/oder PCR mit hoher Empfindlichkeit entwickelt und besitzt eine 3 - 4X höhere Wiedergabegenauigkeit als die Taq-Polymerase. In der Hotstart-Formulierung wird KAPA Long Range mit einem proprietären Antikörper kombiniert, der das Enzym bis zum ersten Denaturierungsschritt inaktiviert, wodurch unerwünschte Amplifikationsprodukte vermieden und die Reaktionseffizienz und -empfindlichkeit erhöht werden.

Die KAPA Long Range PCR-Kits sind ideal geeignet für:

• PCR-Amplifikation langer Ziele und/oder PCR mit geringen Mengen an Template-DNA
• Standard-PCR-Amplifikation im kurzen und mittleren Bereich
• Herstellung von PCR-Produkten, die für die Ligation in 3'-T-Überhängen der Klonierungsvektoren verwendet werden können

Zu den Vorteilen gehören:

• Amplifikation von Targets mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität bis zu 15 kb
• Hohe Ausbeute bei geringer Ausgangs-DNA
• Bietet hohe Ausbeute, höhere Empfindlichkeit und Spezifität, wo andere Distanz-Systeme versagen*

Abbildung 11. Amplifikation der Template-Verdünnung humaner genomischer DNA, beginnend mit 50 ng, 10 ng, 2 ng, 400 pg pro 25 μl. Längen der Amplikons waren 737 bp, 1,3 kb, 3,3 kb und 4,5 kb 35 Zyklen, 72 ºC Polymerisationstemperatur.

Abbildung 12. Amplifikation der Template-Verdünnung humaner genomischer DNA, beginnend mit 50 ng, 10 ng, 2 ng, 400 pg pro 25 μl. Längen der Amplikons waren 7,5 kb 10,5 kb, 13 kb und 15 kb. 35 Zyklen, 68 ºC Polymerisationstemperatur.

Abbildung 13. *Amplifikation eines 4,5 kb-Fragments aus 50 ng, 10 ng, 2 ng und 400 pg humaner genomischer DNA pro 25 μl-Reaktion. Bahnen: (M) Marker, (1 - 4) KAPA Long Range HotStart, (5 - 8) Competitor T, (13 - 16) Competitor R.

KAPA MAUS-GENOTYPISIERUNG

In nur einer Stunde vom Tail zum Typ

KAPA Maus-Genotypisierungskits ermöglichen eine zuverlässige Extraktion und Amplifikation von DNA-Fragmenten aus Mausgewebe in nur einer Stunde, während konventionelle Protokolle ≥ 1 Tag dafür benötigen. KAPA Express Extract, ein neues thermostabiles Protease- und Puffersystem, das die Extraktion von PCR-bereiter DNA aus Mausgewebe in nur 15 Minuten ermöglicht, sowie KAPA2G Fast Genotypisierungsmix mit Farbstoff, der eine DNA-Polymerase enthält, die durch gerichtete Evolution für hohe Verarbeitbarkeit und extreme Geschwindigkeit optimiert wurde.

KAPA-Maus-Genotypisierungskits bieten:

• 15-Minuten-Extraktion zur Entfernung organischer Lösungsmittel, für pH-Neutralisierung und Zentrifugation
• 45-Minuten-Amplifikation mit hoher Prozessivität und bei extremer Geschwindigkeit
• Komfortables Mastermix-Format mit Ladefarbstoff in Hot-Start- und Nicht-Hot-Start-Formulierungen

Übertrifft Rohextraktionsmethoden und kommerzielle Kits

• Verbesserte Durchlaufzeiten und Spezifität
• Reduzierte Kosten

Abbildungen 14 und 15. Im Vergleich zum Quanta-Kit für die Maus-Genotypisierung weisen die KAPA Maus-Genotypisierungskits eine erhöhte Sensitivität, Ausbeute und Spezifität in der Multiplex-PCR auf. Die Reaktionen wurden mit Hybridisierung bei 50 °C oder 60 °C durchgeführt, um die Auswirkungen der Verwendung suboptimaler Hybridisierungstemperaturen in Genotypisierungsassays zu demonstrieren.

Höherer Durchsatz, schnellere Verarbeitungszeit und höhere Zuverlässigkeit

• PCR-bereite DNA in nur 15 Minuten
• Reduzierte Gefahr von Probenverlust oder Kontamination durch minimales Handling
• Ausreichende Template-Menge für mehrere Assays; einfach skalierbar für Proben in einem 96-Well-Format
• Schnelle und zuverlässige Amplifikation von DNA-Fragmenten über eine große Bandbreite von Amplikon-Längen und GC-Inhalten

Abbildungen 16 und 17. A) Die für die DNA-Extraktion und -Amplifikation benötigte Gesamtzeit wurde mit dem KAPA Maus-Genotypisierungskit, Proteinase K und Wildtyp-Taq sowie alkalischer Lyse und Wildtyp-Taq verglichen. B) Die Ergebnisse für fünf Amplikons (312 - 915 bp), die mit dem KAPA Maus-Genotypisierungskit (1) generiert wurden, wurden mit denen verglichen, die aus zwei häufig verwendeten Methoden (2 und 3) hervorgingen. Mit dem KAPA Maus-Genotypisierungskit wurden DNA-Lysate aus Mäuseschwänzen mit dem schnellen (15 Minuten) KAPA Express Extract-System (ein Röhrchen) hergestellt. Die Amplifikation mit dem KAPA2G Fast HotStart ReadyMix mit Farbstoff war in 45 Minuten abgeschlossen. Im Gegensatz dazu wurden DNA-Lysate mit einem ~3,5-stündigen Proteinase-K-Protokoll (2) oder einer schnellen (~2,5 Stunden) alkalischen Lyse-Methode (3) hergestellt. In beiden Fällen wurde die Amplifikation mit Wildtyp-Taq durchgeführt (1,5 Stunden Zyklusprotokoll). Die mit dem KAPA Maus-Genotypisierungskit erzielten Ergebnisse waren gleichwertig oder besser (spezifischer) als die mit anderen Methoden erzielten Ergebnisse, die (abhängig vom genauen verwendeten DNA-Extraktionsprotokoll) mindestens viermal so lange oder bis zu einem Tag dauern können.

KAPA EXPRESS EXTRACT

Schnelle und effiziente DNA-Extraktion

KAPA Express Extract ist ein neuartiges thermostabiles Protease- und Puffersystem, das die Extraktion von PCR-bereiter DNA in nur 15 Minuten ermöglicht. DNA-Extraktionen werden bequem in einem einzelnen Röhrchen durchgeführt, wodurch das Risiko von Probenverlusten und Kontaminationen erheblich reduziert wird. Die Kombination aus KAPA Express Extract und KAPA2G Robust HotStart ReadyMix bietet eine leistungsstarke Lösung für eine schnelle DNA-Extraktion und eine konsistente Downstream-Amplifikation.

KAPA Express Extract bietet:

• Ein schnelles Extraktionsprotokoll mit PCR-bereiter DNA in nur 15 Minuten für eine konsistente Downstream-Amplifikation von schwierigen Probentypen
• Ein vielseitiges, optimiertes Kit für die erfolgreiche DNA-Extraktion aus einer Vielzahl von Proben und Gewebetypen, darunter Wangenabstriche, Haarfollikel, Fischgewebe und Vogelfedern
• Durch Einzelröhrchen-Reaktion wird das Risiko einer Kontamination minimiert
• Effiziente Extraktion aus "Guthrie"-Karten, FTA® Elute-Karten und FTA-Karten

Abbildungen 18 und 19. Die DNA wurde mit KAPA Express Extract aus verschiedenen Säuger- und Fischproben extrahiert. Von jedem Extrakt wurden 2 μl direkt (ohne Quantifizierung) in einer PCR verwendet, die den KAPA2G Robust HotStart ReadyMix und Primer für das ~650 bp Cytochrom-c-Oxidase I-Genfragment enthielt, das üblicherweise bei der Artenidentifizierung verwendet wird (Ivanova, et al., 2007). Die PCR-Produkte (10 μl) wurden in einem 1% Agarosegel analysiert. Herkunft und Art der Probe werden oberhalb des Gels angezeigt. Die Reaktionsprodukte wurden direkt in Standard-Sanger-Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung von out-nested M13-Primern verwendet (2 μl PCR-Produkt pro 10 μl Sequenzierungsreaktion). Die Sequenzdaten waren von hoher Qualität und ermöglichten die Identifizierung der einzelnen Arten. Ein Ausschnitt der Sequenzspur aus dem Gewebe von Seriola lalandi (Gelbschwanz-Bernsteinmakrele) ist im unteren Feld dargestellt.

Abbildung 20. Die DNA-Extrakte wurden aus zwei verschiedenen FFPE-Proben mit KAPA Express Extract hergestellt. Jedes Extrakt wurde direkt (ohne Quantifizierung) in mehreren PCR mit KAPA2G Robust HotStart ReadyMix und Primern für fünf verschiedene Fragmente (293 bp - 1 kb) des EGFR-Gens (entsprechend den Exons 18 - 21 und 24) verwendet. Die Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die mit den gleichen Reaktions- und Zyklusbedingungen, aber unter Verwendung von 1 ng aufgereinigter menschlicher genomischer DNA als Template erzielt wurden. Mit Ausnahme des 1-kb Exon-24-Fragments aus der älteren Probe waren die Ausbeuten und die Reaktionseffizienz zwischen den FFPE-DNA-Extrakten und der aufgereinigten genomischen DNA vergleichbar. Die aus Probe 1 erzeugten PCR-Produkte wurden 1:10 verdünnt und direkt in Standard-Sanger-Sequenzierungsreaktionen verwendet. Die Sequenzdaten (unteres Feld, Exon-19-Fragment von Probe 1) waren von hoher Qualität. Durch die gemischte Sequenz, die an der mit dem Pfeil markierten Stelle beginnt, wurde die Gegenwart einer 15-nt-Deletion bestätigt, die mit dem nicht-kleinzelligen Karzinom assoziiert ist, das bei dem Patienten diagnostiziert wurde, von dem Probe 1 entnommen wurde.

Abbildung 21. Extraktion und Amplifikation von DNA aus verschiedenen Blutprobentypen zum Nachweis des HLA-B*27-Allels. Die DNA wurde aus 12 menschlichen EDTA-Blutproben mit KAPA Express Extract extrahiert (oberes Panel). 2 μl jedes Extrakts wurden direkt zu einer 25-μl-PCR gegeben, die den KAPA2G Robust HotStart ReadyMix und zwei Primersätze enthielt. Der Primersatz für die interne Kontrolle zielt auf ein 429 bp-Fragment des Beta-Globin-Gens ab, während der zweite Primersatz sequenzspezifisch auf ein 141 bp-Fragment des HLA-B*27-Lokus abzielt. Zwei der 12 Personen wurden positiv auf das HLA-B*27-Allel getestet, das mit Spondylitis ankylosans assoziiert ist. Die Bahnen C- und C+ stellen HLA-B*27-Negativ- bzw. Positivkontrollen dar (1 ng aufgereinigte humane genomische DNA als Template). Die DNA wurde aus "Guthrie"-Karten, FTA-Karten oder FTA-Elute-Karten (unteres Panel) extrahiert, auf denen Blut von Personen aufgetragen wurde, die nachweislich HLA-B*27-positiv (+) oder -negativ (-) sind. Die Bedingungen für die DNA-Extraktion und -Amplifikation sowie die Kontrollen (C- und C+) waren identisch mit dem oberen Panel.

KAPA3G Pflanzen-PCR-Kit

Die KAPA 3G-Pflanzen-PCR-Kits sind so konzipiert, dass entweder aufgereinigte DNA oder rohe extrahierte DNA für die PCR von aus Pflanzen gewonnener DNA verwendet wird. Das Kit enthält eine KAPA3G-DNA-Polymerase, die so konstruiert wurde, dass sie eine erhöhte Toleranz gegenüber gängigen pflanzlichen PCR-Inhibitoren wie Polyphenolen und Polysacchariden aufweist.

KAPA3G-Pflanzen-PCR-Kits bieten:

• Schnelle PCR direkt aus Pflanzengeweben wie Blattscheiben, Samen und Pflanzenrohextrakten
• Rationalisierte Arbeitsabläufe für transgenes Screening
• Verbesserte PCR-Erfolgsraten und Reproduzierbarkeit

Rationalisierung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Verarbeitungszeiten

• PCR-Durchführung in der Hälfte der Zeit im Vergleich zu Wildtyp-Enzymen
• Vermeiden der Notwendigkeit zeitaufwändiger DNA-Extraktionen
• Eignung für direkte PCR

Abbildung 22. Die direkte PCR mit dem KAPA3G-Pflanzen-PCR-Kit übertrifft die CTAB-Extraktion und die Standard-PCR mit Wildtyp-Taq bei deutlich kürzeren Durchlaufzeiten.

Amplifikation langer Targets aus Rohproben und aufgereinigter DNA

• Amplifizieren von Fragmenten bis zu 5 kb
• Hohe Ausbeute und Spezifität

Abbildung 23. Targets unterschiedlicher Länge (297 bp und 4100 bp aus Tabak, 640 bp aus Tomate, 1221 bp aus Weinrebe und 1448 bp und 2249 bp aus Kartoffel) wurden aus aufgereinigter DNA (+) oder Blattscheiben (L) mit dem KAPA3G Pflanzen-PCR-Kit amplifiziert. Für jede Art wurde genomische DNA mit einem handelsüblichen DNA-Aufreinigungskit aufgereinigt. Das Rohmaterial wurde mit einem Harris Uni-Core™ Probenahmegerät mit 0,5 mm Durchmesser entnommen. Aufgereinigte DNA (1 - 10 ng pro Reaktion, je nach Art) und Rohproben wurden als Templates in 50 μl PCR mit 40 Amplifikationszyklen verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 1 % Agarosegel analysiert. Die KAPA Express DNA-Leiter (100, 200, 400, 800, 1600, 4000, 8000 bp) wurde als MW-Marker verwendet.

Durchführung direkter PCR aus einer Vielzahl von Pflanzenarten und Gewebetypen

• Direkte PCR mit Blattscheibe oder Samen als Template
• Zeitaufwändige DNA-Extraktionen sind nicht erforderlich

Abbildung 24. Die genomische DNA der Pflanzen wurde aus allen Arten mit einem handelsüblichen DNA-Aufreinigungskit aufgereinigt. Ein Harris Uni-Core™ Probenahmegerät (0,5 mm Durchmesser) wurde für die Probenahme von Blättern (alle Arten) oder Samen eingesetzt (alle Arten außer Tabak und Arabidopsis; für diese wurde ein zerkleinerter Samen pro Reaktion verwendet). Die PCR (50 μl) enthielten die Rohprobe oder 1 - 10 ng aufgereinigte DNA (je nach Art), und es wurden in allen Fällen 40 Zyklen durchgeführt. Die Targets lagen zwischen 500 und 900 bp, und die Reaktionsprodukte wurden in einem 1 % Agarosegel analysiert. Die KAPA Express DNA-Leiter (100, 200, 400, 800, 1600, 4000, 8000 bp) wurde als MW-Marker verwendet.

Verbesserung der Erfolgsquoten mit neuartigem PCR-Workflow für Rohproben aus Pflanzen

• Verwenden Sie Extraktionspuffer, um Rohextrakte für die Pflanzen-PCR in nur 5 Minuten herzustellen
• Hohe Erfolgsraten selbst bei den schwierigsten Probentypen

Abbildung 25. Die Rohproben-PCR mit dem Primerpaar-Tab c/d wurde an Blättern und/oder Samen aus 8 Pflanzen mit 1 μl eines Rohextrakts ohne Wärmebehandlung (links) oder 1 μl eines Rohextrakts mit Wärmebehandlung (rechts) durchgeführt. Die Reaktionen wurden eingestellt, wie im KAPA3G Pflanzen-PCR-Kit TDS beschrieben, und es wurden 45 PCR-Zyklen mit Hybridisierung bei 55°C und einer 20 Sekunden Erweiterung bei 72°C pro Zyklus durchgeführt. Die KAPA Express DNA-Leiter (100, 200, 400, 800, 1600, 4000, 8000 bp) wurde als MW-Marker verwendet. 1: Eukalyptus; 2: Weinrebe; 3: Weizenblatt; 4: Weizensaatgut; 5: Rapsblatt; 6: Rapssamen; 7: Reissamen; 8: Gerstenkorn; 9: Maiskorn; 10: Baumwollsamen; 11: Baumwollblatt.