Plasmid-DNA-Aufreinigung
Einführung in die Plasmidaufreinigung
Die Extraktion von Makromolekülen wie DNA, RNA und Proteinen ist in der molekularbiologischen Forschung üblich. Der Extraktions- und Aufreinigungsprozess von Nukleinsäuren hat sich von einem komplexen und arbeitsintensiven Verfahren weiterentwickelt. Die aktuellen Nukleinsäureaufreinigungsverfahren bieten eine hohe Probenausbeute, Reinheit und Skalierbarkeit von Biomolekülen bei minimaler Kreuzkontamination. Üblicherweise werden auch automatisierte Systeme verwendet, die für mittelgroße bis große Labore entwickelt wurden.
Nukleinsäuren für die Plasmidaufreinigung vorbereiten
Die Vorbereitung von Nukleinsäuren beginnt mit dem Prozess der Probennahme (Bakterien, Tiergewebe und -zellen oder Pflanzengewebe). Durch die geeignete Entnahme und Handhabung der Proben wird, unabhängig von dem Verfahren, das für die DNA-Aufbereitung verwendet wird, eine Nukleinsäure mit hoher Qualität erzielt. Der Weg von der Probennahme zur Nukleinsäureaufreinigung kann Probennahme, Transport, Archivierung, Lagerung und Aufreinigung von Nukleinsäuren als Arbeitsablauf einschließen (Abb. 1).
Abbildung 1.Arbeitsablauf für Probennahme, Transport, Archivierung und DNA-Aufreinigung.
Nukleinsäurenisolation
Die Isolation von DNA involviert die Lyse von Zellmembranen, das Entfernen von Histonproteinen, RNA und Lipiden sowie die Aufreinigung. In Tabelle 1 werden verschiedene verfügbare Verfahren zum Extrahieren und Aufreinigen veranschaulicht.
Plasmid-DNA
Plasmide sind kleine, kreisförmige, doppelsträngige DNA, die in der Molekularbiologie zum Manipulieren und Dekodieren von genetischen Informationen eingesetzt werden. Sie haben sich zu Schlüsselkomponenten in allen Klonierungs- und biotechnologischen Techniken entwickelt, da sie leichter zu verändern sind.
Verschiedene Verfahren für die Plasmid-DNA-Aufreinigung wurden entwickelt. Wir verpflichten uns, Ihnen umweltfreundlichere Alternativprodukte anzubieten, die einen oder mehrere der „12 Grundsätze der Grünen Chemie“ erfüllen. Die GenElute-Produkte weisen eine inhärent sicherere Chemie auf, verglichen mit der gängigen Verwendung von Phenol und Chloroform, um DNA-Extraktionen durchzuführen.
Das GenElute™ Plasmid-Miniprep-Kit ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli-Kulturen. Das Kit kombiniert eine Membrantechnologie auf Siliziumdioxidbasis mit der Annehmlichkeit eines Spinsäulenformats und gewinnt je ml Übernachtkultur bis zu 20 mg Plasmid-DNA mit hoher Kopienzahl. Folgende sind die Hauptschritte (Abb. 2) der Isolation und Aufreinigung von Plasmid-DNA mit dem GenElute™ Plasmid-Miniprep-Kit.
- Bakterienzellen werden mittels Zentrifugieren geerntet, einem modifizierten alkalischen SDS-Lyseverfahren unterzogen und die DNA in Gegenwart einer hohen Salzkonzentration auf Siliziumdioxid adsorbiert.
- Verunreinigungen werden anschließend durch einen einfachen Waschschritt entfernt.
- Die gebundene DNA wird in Wasser oder Tris-EDTA-Puffer eluiert. Die gewonnene Plasmid-DNA liegt überwiegend in ihrer Supercoiled-Form vor.
- Die DNA ist für die Verwendung in Anwendungen wie Restriktionsenzymverdau, Klonen, PCR-Umwandlung, Transkription, konventionelle und automatisierte Sequenzierung bereit.
Einige unserer Plasmid-DNA-Aufreinigungskits sind in Tabelle 2 aufgelistet. Detaillierte Erklärung der verschiedenen Plasmid-DNA-Aufreinigungsverfahren (PDF)
Abbildung 2.Arbeitsablauf für die Nukleinsäurenaufbereitung und -aufreinigung aus Plasmiden. PCR-DNA-Reinigung: Produktnummern NA1020 und PCR9604
Literatur
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