Protokoll für das GenElute™-Miniprep-Kit für genomische Säugetier-DNA ;
Produktbeschreibung
Das GenElute™-Miniprep-Kit für genomische Säugetier-DNA bietet eine einfache und praktische Möglichkeit, reine genomisch DNA aus verschiedenen kultivierten Zellen, Geweben (einschließlich Nagetierschwänze) und frischem Vollblut oder Leukozyten zu isolieren. Das Kit kombiniert die Vorteile einer Siliziumdioxidbindung mit einem Mikrospinformat und eliminiert die Notwendigkeit für teure Harze, Alkoholfällung und gefährliche organische Verbindungen wie Phenol und Chloroform. Die Ausgangsmaterialien werden in einer chaotropen salzhaltigen Lösung lysiert, um die gründliche Denaturierung von Makromolekülen sicherzustellen. Die Zugabe von Ethanol sorgt dafür, dass die DNA bindet, wenn das Lysat durch eine Siliziumdioxidmembran in ein Mikrozentrifugenröhrchen gesponnen wird. Um nach dem Waschen Verunreinigungen zu entfernen, wird die DNA in 200 µl einer Tris-EDTA-Lösung gelöst.
Die erwartete Ausbeute von genomischer DNA variiert abhängig von der Menge und Art des verwendeten Ausgangsmaterials (zum Beispiel können aus 2 × 106 HeLa-Zellen in weniger als einer Stunde 15–25 µg mit RNase A behandelter DNA isoliert werden). Mit dem Kit aufgereinigte DNA weist ein A260/A280-Verhältnis von 1,6 bis 1,9 auf und kann bis zu 50 kb lang sein. Die DNA ist für Downstream-Anwendungen wie Restriktionsendonukleaseverdau, PCR, Southern Blot und Sequenzierungsreaktionen bereit.
Erforderliche, aber nicht bereitgestellte Reagenzien und Ausrüstung
· 55 °C-Wasserbad oder -Schüttelwasserbad
· 70 °C-Wasserbad oder Heizblock
· Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere (empfohlen)
· 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen für die Lyse
· Mikrozentrifuge (2-ml-Röhrchen, mit Rotor)*
· Ethanol (95–100 %), Katalognr.: E7148, E7023 oder 459836
· Für die Molekularbiologie geeignetes Wasser, Katalognr.: W4502
* Hinweis: Um sicherzustellen, dass alle Röhrchen richtig sitzen, wird ein Rotor mit 24 Plätzen empfohlen. Wenn Sie einen
Rotor mit 36 Plätzen verwenden, wird für einen richtigen Sitz der Röhrchen empfohlen, nur jeden zweiten Platz zu verwenden
Lagerung und Haltbarkeit
Lagern Sie das Kit bei Raumtemperatur. Falls Reagenzien des Kits ausfällen, erwärmen Sie sie auf 55–65 °C, bis die Ausfällung gelöst ist und lassen Sie sie vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
Aufbereitungsanleitung
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, gehen Sie wie folgt vor:
1. Wärmen Sie das Wasserbad oder Schüttelwasserbad auf 55 °C vor
Zur Verwendung mit Geweben, Nagetierschwänzen, frischem Vollblut und Leukozyten.
2. Wärmen Sie das Wasserbad oder den Heizblock auf 70 °C vor
Zur Verwendung mit kultivierten Zellen und Geweben.
3. Mischen Sie die Reagenzien gründlich
Überprüfen Sie die Reagenzien auf Ausfällung. Falls Reagenzien Ausfällungen bilden, erwärmen Sie sie auf 55–65 °C, bis die Ausfällung gelöst ist, und lassen Sie sie vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
4. Verdünnen Sie das Waschlösungskonzentrat
Verdünnen Sie das Konzentrat mit 10 ml (10-Aufbereitungen-Packung) 80 ml (70-Aufbereitungen-Packung) oder 360 ml (350-Aufbereitungen-Packung) 95–100 % Ethanol. Verschließen Sie die verdünnte Waschlösung nach jedem Gebrauch dicht, um eine Ethanolverdampfung zu verhindern.
5. Lösen Sie Proteinase K in Wasser
Lösen Sie das Pulver aus einer (1) Flasche Proteinase K gemäß Tabelle 1 in Wasser (Katalognr.: W4502), um eine 20-mg/ml-Stammlösung zu erhalten. Diese Lösung kann mehrere Tage bei 2–8 °C aufbewahrt werden. Für die Langzeitlagerung kann der nicht verwendete Teil der Lösung bis zum Gebrauch bei -20 °C in Aliquoten aufbewahrt werden. Dieses Produkt ist zum Zeitpunkt der Lieferung bei Raumtemperatur stabil.
Die Proteinase-K-Lösung muss jedes Mal direkt zu jeder Probenaufbereitung gegeben werden. Kombinieren Sie die Proteinase-K- und Lyselösungen für die Lagerung nicht.
Verfahren
Hinweis: Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie im folgenden Verfahren statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität.
A. Aufbereitung von kultivierten Zellen
1a. Zellernte
• Anhaftende Zellkulturen: Zellen mit Trypsin freisetzen. Bilden eines Rückstands von bis zu 5 × 106 Zellen für 5 Minuten bei 300 × g. Entfernen Sie das Kulturmedium vollständig und entsorgen Sie es. Gehen Sie zu Schritt 2a.
• Suspensionszellkulturen: Bilden eines Rückstands von bis zu 5 × 106 Zellen für 5 Minuten bei 300 × g. Entfernen Sie das Kulturmedium vollständig und entsorgen Sie es. Fahren Sie mit Schritt 2a fort.
Hinweis: Die Zellen können geerntet, in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei
–70 °C mehrere Monate lang gelagert werden, bevor die DNA aufbereitet wird.
2a. Zellen resuspendieren
Resuspendieren Sie den Rückstand gründlich in 200 µl Resuspensionslösung. Falls er gefroren war, lassen Sie den Zellrückstand vor dem Resuspendieren leicht antauen. Falls Rest-RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 3a fort.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls RNA-freie genomische DNA benötigt wird, geben Sie 20 μl RNase-A-Lösung hinzu und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit Schritt 3a fort.
3a. Zelllyse
Geben Sie 20 μl Proteinase-K-Lösung, gefolgt von 200 μl Lyselösung C (B8803) zu der Probe. Vortexen Sie gründlich (etwa 15 Sekunden) und inkubieren Sie bei 70 °C für 10 Minuten. Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
Abbildung 1.Genomische DNA, die mit dem GenElute™-Aufreinigungskit für genomische Säugetier-DNA aus Zellen aufgereinigt wurde. Die aufgereinigte genomische DNA wurde mit dem GenElute™-Aufreinigungskit für genomische Säugetier-DNA aus 2 × 106 Zellen der angegebenen Quellen isoliert. Die genomische DNA (200 ng/Spur) wurde auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert. Die Marker sind Lambda-DNA, die mit Hind III aufgeschlossen wurde.
B. Aufbereitung von Säugetiergewebe
1b. Gewebeaufbereitung
Zerkleinern Sie schnell ein Stück frisches oder gefrorenes Gewebe und wiegen Sie es. Lassen Sie gefrorenes Gewebe vor dem Anfertigen von Schnitten leicht antauen, belassen Sie es aber auf Eis, um es vor der Zersetzung zu schützen. Das Zerschneiden von Gewebe in kleine Stücke ermöglicht eine effiziente Lyse. Bis zu 25 mg Gewebe (oder 10 mg Milz, aufgrund der hohen Anzahl von Zellen je gegebener Masse) können je Aufbereitung verwendet werden. Geben Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und gehen Sie zu Schritt 2b.
Hinweis: Gewebe kann geerntet, in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend mehrere Monate bei
–70 °C gelagert werden, bevor die DNA aufbereitet wird.
2b. Gewebeaufschluss
Geben Sie 180 µl Lyselösung T (B6678) gefolgt von 20 µl Proteinase-K-Lösung zu dem Gewebe. Mischen durch Vortexen. Inkubieren Sie die Probe bei 55 °C, bis das Gewebe vollständig aufgeschlossen ist und keine Teilchen mehr übrig sind. Vortexen Sie gelegentlich oder verwenden Sie ein Schüttelwasserbad. Der Aufschluss ist innerhalb von 2 bis 4 Stunden abgeschlossen. Vortexen Sie kurz, nachdem der Aufschluss abgeschlossen ist.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls restliche RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 3b fort. Falls RNA-freie genomische DNA erforderlich ist, geben Sie 20 μl RNase-A-Lösung zu und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit Schritt 3b fort.
3b. Zelllyse
Geben Sie 200 μl Lyselösung C (B8803) zu der Probe. Vortexen Sie gründlich (etwa 15 Sekunden). Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse. Bei 70 °C 10 Minuten inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
Abbildung 2. Genomische DNA, die mit dem GenElute™-Aufreinigungskit für genomische Säugetier-DNA aus Gewebe aufgereinigt wurde.Aufgereinigte genomische DNA aus den indizierten Mausgeweben wurde mit dem GenElute™-Aufreinigungskit für genomische Säugetier-DNA isoliert. Die genomische DNA (200 ng/Spur) wurde auf einem 0,8%igen Agarosegel analysiert, um die Ausbeute und Intaktheit aufzuzeigen. Die Marker sind Lambda-DNA, die mit Hind III aufgeschlossen wurde.
C. Nagetierschwanzaufbereitung
1c. Nagetierschwanzaufbereitung
Messen und schneiden Sie schnell ein Stück frischen oder gefrorenen Nagetierschwanz. Lassen Sie den gefrorenen Nagetierschwanz vor dem Schneiden leicht antauen, belassen Sie es aber auf Eis, um es vor der Zersetzung zu schützen. Verwenden Sie nicht mehr als 0,6 cm (Ratte) oder 1,2 cm (Maus) Schwanz je Aufbereitung. Schneiden Sie zwei (Maus) oder einen (Ratte) 0,5-0,6 cm lange Schwanzstücke ab und füllen Sie sie in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein. Gehen Sie zu Schritt 2c.
Hinweis: Nagetierschwänze können vor der DNA-Aufbereitung mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
2c. Gewebeaufschluss
Geben Sie 180 µl Lyselösung T (B6678) gefolgt von 20 µl Proteinase-K-Lösung zu dem Nagetierschwanz. Mischen durch Vortexen. Stellen Sie sicher, dass der Schwanz vollständig bedeckt ist. Inkubieren Sie die Probe bei 55 °C, bis das Schwanzgewebe vollständig aufgeschlossen ist. Einige Teilchen (Knochen und Haare) können übrig bleiben. Vortexen Sie während der Inkubation gelegentlich oder verwenden Sie ein Schüttelwasserbad für einen schnelleren Aufschluss. Der Aufschluss ist innerhalb von 3 bis 6 Stunden abgeschlossen. Vortexen Sie kurz, nachdem der Aufschluss abgeschlossen ist. Falls Rest-RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 3 fort.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls RNA-freie genomische DNA benötigt wird, geben Sie 20 μl RNase-A-Lösung zu und inkubieren Sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit Schritt 3c fort.
3c. Zelllyse
Geben Sie 200 μl Lyselösung C (B8803) zu der Probe. Vortexen Sie gründlich (etwa 15 Sekunden). Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
D. Vollblutaufbereitung
1d. Gewinnung von Vollblut
Sammeln Sie Vollblut in einem Antikoagulansröhrchen (ein EDTA-Röhrchen wird bevorzugt). Das Vollblut sollte vor Beginn der Aufbereitung bei Raumtemperatur equibriliert werden.
2d. Blutaufbereitung
Geben Sie 20 μl Proteinase-K-Lösung in ein 1,5-µl-Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie bis zu 200 µl der Vollblutprobe in das Röhrchen. Falls die Probe ein geringeres Volumen als 200 µl aufweist, geben Sie Resuspensionslösung zu, um das Volumen auf 200 µl zu bringen.
Hinweis: Falls sich die Probe bereits in einem Röhrchen befindet, kann die Proteinase-K-Lösung zu der Probe gegeben werden. Vortexen Sie, um ein gründliches Mischen des Enzyms zu gewährleisten. Vollblut kann vor der DNA-Aufbereitung mehrere Stunden bei 4 °C aufbewahrt werden. Falls restliche RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 3d fort.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls RNA-freie genomische DNA erforderlich ist, geben Sie 20 μl RNase-A-Lösung zu und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit Schritt 3d fort.
3d. Zelllyse
Geben Sie 200 μl Lyselösung C (B8803) zu der Probe. Vortexen Sie gründlich (etwa 15 Sekunden). Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse. Bei 55 °C 10 Minuten inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
E. Leukozytenaufbereitung
1e. Aufbereitung von Leukozyten aus Vollblut
Aufbereitung von Leukozyten aus 500 µl Vollblut je Aufbereitung; Anhang für ein Ammoniumchloridlyseverfahren.
2e. Zellen resuspendieren
Resuspendieren Sie den Rückstand gründlich in 200 µl Resuspensionslösung. Geben Sie 20 µl Proteinase-K-Lösung zu der Probe und vortexen Sie kurz, um ein gründliches Mischen des Enzyms zu gewährleisten. Falls restliche RNA kein Problem darstellt, fahren Sie mit Schritt 3e fort.
Optionale Behandlung mit RNase A: Falls RNA-freie genomische DNA erforderlich ist, geben Sie 20 μl RNase-A-Lösung zu und inkubieren Sie 2 Minuten bei Raumtemperatur. Fahren Sie anschließend mit Schritt 3e fort.
3e. Zelllyse
Geben Sie 200 μl Lyselösung C (B8803) zu der Probe. Vortexen Sie gründlich. Eine homogene Mischung ist essenziell für eine effiziente Lyse. Bei 55 °C 10 Minuten inkubieren. Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
DNA-Isolation aus allen gelisteten Arten von Proben
Dies ist eine Fortführung des Verfahrens für Proben, die in den Abschnitten A, B, C, D und E aufbereitet wurden.
4. Säulenvorbereitung
Geben Sie 500 μl der Säulenvorbereitungslösung zu jeder vormontierten GenElute™ Miniprep-Bindungssäule (mit einem roten O-Ring; nicht zu verwechseln mit anderen GenElute™-Kits) und zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 1 Minute. Entsorgen Sie die Durchflussflüssigkeit.
Hinweis: Die Säulenvorbereitungslösung maximiert die Bindung von DNA an die Membran, wodurch konsistentere Ausbeuten erzielt werden.
5. Vorbereitung für die Bindung
Geben Sie 200 µl Ethanol (95–100 %) zu dem Lysat. Mischen Sie gründlich durch Vortexen für 5–10 Sekunden. Eine homogene Lösung ist essenziell.
6. Lysat beladen
Übertragen Sie den gesamten Inhalt des Röhrchens in die behandelte Bindungssäule aus Schritt 4. Nutzen Sie eine Pipettenspitze mit breiter Bohrung, um das Scheren der DNA beim Übertragen der Inhalte in die Bindungssäule zu reduzieren. Zentrifugieren Sie bei ≥ 6.500 × g für 1 Minute. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit der Durchflussflüssigkeit und geben Sie die Bindungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen.
7. Erstes Waschen
Verdünnen Sie das Waschlösungskonzentrat vor dem ersten Gebrauch mit Ethanol wie unter Aufbereitungsanleitung beschrieben. Geben Sie 500 µl Waschlösung zu der Bindungssäule und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei ≥ 6500 × g. Entsorgen Sie das Sammelröhrchen mit der Durchflussflüssigkeit und geben Sie die Bindungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen.
8. Zweites Waschen
Geben Sie weitere 500 µl Waschlösung zu der Bindungssäule und zentrifugieren Sie für 3 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit (12.000–16.000 × g), um die Bindungssäule zu trocknen. Die Bindungssäule muss vor der Elution der DNA ethanolfrei sein. Zentrifugieren Sie die Säule für eine weitere Minute bei maximaler Geschwindigkeit, falls restliches Ethanol erkennbar ist. Sie können das Sammelröhrchen für diesen zusätzlichen Zentrifugierschritt leeren und wiederverwenden. Entsorgen Sie schließlich das Sammelröhrchen mit der Durchflussflüssigkeit und geben Sie die Säule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen .
9. DNA eluieren
Pipettieren Sie 200 µl der Elutionslösung direkt in die Mitte der Bindungssäule. Zentrifugieren Sie bei ≥ 6.500 × g für 1 Minute, um die DNA zu eluieren. Um die Elutionseffizienz zu steigern, inkubieren Sie nach der Zugabe der Elutionslösung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie anschließend.
Optional: Eine zweite Elution kann durch Wiederholung von Schritt 9 mit weiteren 200 µl Elutionslösung und Elution in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen (mitgeliefert) oder in dasselbe 2-ml-Sammelröhrchen, das für das erste Eluat verwendet wurde, gewonnen werden.
Das Eluat enthält reine genomische DNA. Für die Kurzzeitlagerung von DNA werden 2–8 °C empfohlen. Für die Langzeitlagerung von DNA werden -20 °C empfohlen. Vermeiden Sie einfrieren und auftauen, da dies Brüche in dem DNA-Strang hervorruft. Die Elutionslösung hilft beim Stabilisieren der DNA bei diesen Temperaturen.
DNA-Ausfällung (Optional)
Das GenElute™-Kit für genomische Säugetier-DNA ist derart konzipiert, dass die DNA immer in Lösung bleibt, wodurch Resuspensionsprobleme verhindert werden. Falls es für Sie jedoch notwendig ist, die DNA zu konzentrieren, wird eine Ethanolfällung in Gegenwart von Natriumacetat empfohlen.
Ergebnisse
Die Konzentration und Quantität der genomischen DNA, die mit dem GenElute™-Kit aufbereitet wurde, kann durch spektrophotometrische Analyse und Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden. Verdünnen Sie die DNA in TE-Puffer (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH-Wert 8,0–8,5) und messen Sie die Absorption bei 260 nm und 280 nm mit einer Quarz-Mikroküvette. Die Absorption sollte zwischen 0,1 und 1,0 liegen (oder innerhalb des linearen Bereichs ihres Spektrophotometers). Eine Absorption von 1,0 bei 260 nm entspricht etwa 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu bei 280 nm (A260/A280) sollte von 1,6–1,9 betragen. Die Größe und Qualität der Dann können durch Agarose-Gelelektrophorese bestimmt werden.1 Ein Gel mit 0,8 % Agarose (Katalognr.: A9539) in 0,5 X TBE-Puffer (Katalognr.: T6400) eignet sich gut für die Trennung von genomischer DNA. Die DNA kann durch Färben mit einem interkalierenden Farbstoff wie Ethidiumbromid (Katalognr.: E1510) visualisiert und gegen einen bekannten DNA-Marker wie Lambda-DNA-EcoRI-HindIII-Aufschluss (Katalognr.: D9281) gemessen werden. Die genomische DNA sollte als einzelne Bande mit hoher Molekülmasse und sehr wenigen Hinweisen auf Scheren migrieren. Eine genauere Bestimmung der Größe der DNA kann durch Pulsed-Field-Gelelektrophorese durchgeführt werden.
Leitfaden für die Fehlerbehebung
1. Die Bindungssäule ist verstopft
Ursache – Die Probe ist zu groß.
Lösung – Verwenden Sie künftig weniger Zellen, kleinere Gewebestücke, kleinere Nagetierschwanzstücke oder eine kleinere Menge Vollblut. Um die aktuelle Aufbereitung zu retten, steigern Sie die g-Kraft und/oder zentrifugieren Sie länger, bis das Lysat durch die Bindungssäule läuft. Die Ausbeute von genomischer DNA könnte verringert sein.
Ursache – Gewebe oder Nagetierschwanz wurde ineffizient zerkleinert.
Lösung – Verlängern Sie den Proteinase-K-Aufschluss bei 55 °C. Um die Lyse zu beschleunigen, schneiden Sie das Gewebe oder den Nagetierschwanz in kleinere Stücke und mischen Sie während des Aufschlusses regelmäßig, um eine effizientere Lyse zu gewährleisten. Ein Umdrehen des Probenröhrchens nach dem Proteinase-K-Aufschluss gewährleistet eine homogenere Mischung. Verwenden Sie keine kombinierte Lösung (Proteinase K + Lyselösung), die gelagert wurde.
2. Geringe Ausbeute von genomischer DNA
Ursache – Die Probe könnte alt oder zersetzt sein, ODER das Gewebe wurde ineffizient zerkleinert.
Lösung – Die Ausbeute variiert abhängig von verschiedenen Arten von Zellen, Gewebe und frischem Vollblut. Verwenden Sie Kulturen, bevor sie ihre maximale Dichte erreichen oder vollständig konfluent werden. Ernten Sie Gewebe oder Nagetierschwänze so schnell wie möglich. Verwenden Sie Vollblut innerhalb weniger Stunden. Falls die Proben für den künftigen Gebrauch gelagert werden, schockgefrieren Sie die Zellen oder das Gewebe in flüssigem Stickstoff. Vollblut sollte nicht länger als 12 Stunden bei 4 °C aufbewahrt werden.
Ursache – Die Lysat-/Ethanolmischung ist nicht homogen.
Lösung – Stellen Sie sicher, dass die Lösung homogen ist. Vortexen Sie sie für 5–10 Sekunden, bevor Sie sie zu der Bindungssäule geben. Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität.
Ursache – Die Lysat-/Ethanolmischung ist nicht homogen.
Lösung – Stellen Sie sicher, dass die Lösung homogen ist. Vortexen Sie sie für 5–10 Sekunden, bevor Sie sie zu der Bindungssäule geben. Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität.
Ursache – Die DNA-Elution ist unvollständig.
Lösung – Bestätigen Sie, dass die DNA in 200 µl Elutionslösung eluiert wurde. Die DNA-Ausbeute kann für die meisten Arten von Material durch Inkubieren der Elutionslösung nach Zugabe zur Säule für 5 Minuten bei Raumtemperatur gesteigert werden. Eine zweite und dritte Elution mit 200 µl Elutionslösung können durchgeführt werden.
Ursache – Ethanol wurde während der Bindung weggelassen.
Lösung – Prüfen Sie, dass das Ethanol in Schritt 5 zugegeben wurde, bevor Sie die Probe in Schritt 6 in die Bindungssäule geben.
Ursache – Das Eluat enthält Rest-Ethanol vom Waschen.
Lösung – Ethanol aus dem abschließenden Waschschritt muss entfernt werden, bevor die DNA eluiert wird. Zentrifugieren Sie länger oder ein zweites Mal, um die Membran zu trocknen. Falls ethanolhaltige Durchflussflüssigkeit mit der Bindungssäule in Kontakt kommt, wiederholen Sie den Zentrifugierschritt vor der Elution der DNA.
Ursache – Das Eluat enthält Rest-Ethanol vom Waschen.
Lösung – Ethanol aus dem abschließenden Waschschritt muss entfernt werden, bevor die DNA eluiert wird. Zentrifugieren Sie länger oder ein zweites Mal, um die Membran zu trocknen. Falls ethanolhaltige Durchflussflüssigkeit mit der Bindungssäule in Kontakt kommt, wiederholen Sie den Zentrifugierschritt vor der Elution der DNA.
Ursache – Das Eluat enthält Rest-Ethanol vom Waschen.
Lösung – Ethanol aus dem abschließenden Waschschritt muss entfernt werden, bevor die DNA eluiert wird. Zentrifugieren Sie länger oder ein zweites Mal, um die Membran zu trocknen. Falls ethanolhaltige Durchflussflüssigkeit mit der Bindungssäule in Kontakt kommt, wiederholen Sie den Zentrifugierschritt vor der Elution der DNA.
Ursache – Das Waschlösungskonzentrat wurde vor dem Gebrauch nicht verdünnt.
Lösung – Prüfen Sie, ob das Waschlösungskonzentrat vor dem Gebrauch korrekt mit Ethanol verdünnt wurde.
Ursache – Das Waschlösungskonzentrat wurde vor dem Gebrauch nicht verdünnt.
Lösung – Prüfen Sie, ob das Waschlösungskonzentrat vor dem Gebrauch korrekt mit Ethanol verdünnt wurde.
Ursache – Die DNA wurde mit Wasser statt Elutionslösung eluiert.
Lösung – Für optimale Ausbeuten und Lagerung der aufgereinigten DNA wird die Elutionslösung empfohlen. Falls Wasser für die Elution verwendet wird, vergewissern Sie sich, dass der pH-Wert mindestens 7,0 beträgt, um saure Bedingungen zu vermeiden, da diese die DNA bei einer Langzeitlagerung einer Säurehydrolyse unterziehen könnten.
3. Die Reinheit der DNA ist geringer als erwartet; das Verhältnis von A260/A280 ist zu gering.
Ursache – Die Probe wurde in Wasser verdünnt.
Lösung – Verwenden Sie entweder Elutionslösung (10 mmol/l Tris-HCl, 0,5 mmol/l EDTA, pH-Wert 9,0) oder 10 mmol/l Tris-HCl, pH-Wert 8,0-8,5 als Eluant.
Ursache – Der Messwert des Hintergrunds ist aufgrund von Siliziumdioxidfeinteilen hoch.
Lösung – Zentrifugieren Sie die DNA-Probe 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit. Verwenden Sie den Überstand, um die Absorptionsmessungen zu wiederholen.
4. Die Reinheit der DNA ist geringer als erwartet; das Verhältnis von A260/A280 ist zu hoch
Ursache – Die genomische DNA ist mit RNA kontaminiert.
Lösung – Künftige Isolationen sollten einen Behandlungsschritt mit RNase A einschließen, oder das Endprodukt sollte mit RNase-A-Lösung behandelt und erneut aufgereinigt werden.
5. Die DNA ist geschert.
Ursache – Die genomische DNA wurde unsachgemäß gehandhabt.
Lösung – Dieses Kit wurde zum Entfernen von DNA-Ausfällung und gängigen Resuspensionsschritten konzipiert, die in anderen Kits für genomische DNA vorkommen und zu scheren führen können. Alle Pipettierschritte sollten so behutsam wie möglich durchgeführt werden. Pipettenspitzen mit breiter Öffnung werden empfohlen, um scheren zu eliminieren. Falls für Downstream-Anwendungen minimal gescherte DNA gewünscht wird, z. B. wenn das Endprodukt für lange PCR-Amplifikation eingesetzt wird, mischen Sie statt durch Vortexen durch vorsichtiges Pipettieren oder Umdrehen bis zur Homogenität.
Ursache – Die Probe ist alt, zersetzt oder wurde wiederholten Einfrier-/Auftauzyklen unterzogen.
Lösung – Altes Ausgangsmaterial kann zersetzte DNA in dem Eluat erzeugen. Frische Zell- und Gewebe-, Nagetierschwanz- und Vollblutaufbereitungen sollten umgehend verwendet werden. Alternativ können Zellen und Gewebe in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis sie benötigt werden bei -70 °C gelagert werden. Nagetierschwänze können bei -20 °C mehrere Wochen und bei -70 °C mehrere Monate gelagert werden. Vollblut kann bei 4 °C bis zu 12 Stunden aufbewahrt werden.
6. Downstream-Anwendungen sind gehemmt
Ursache – Ethanol wird in die endgültige genomische DNA-Aufbereitung übertragen.
Lösung – Lassen Sie die Durchflussflüssigkeit nach dem abschließenden Waschen der Bindungssäule (Schritt 8) nicht mit der Säule in Kontakt kommen. Zentrifugieren Sie die Säule falls nötig erneut für 1 Minute bei maximaler Geschwindigkeit (12.000–16.000 × g), nachdem Sie das Sammelröhrchen entleert haben.
Ursache – Salz wird in die endgültige genomische DNA-Aufbereitung übertragen.
Lösung – Stellen Sie sicher, dass die Bindungssäule in ein neues 2-ml-Sammelröhrchen gegeben wird, bevor Sie im Schritt 8 die Waschlösungen zugeben.
Anhang: Ammoniumchloridlyseverfahren zum Isolieren von Leukozyten aus Vollblut
1. Sammeln von Vollblut in einem Antikoagulansröhrchen.
2. Geben Sie 500 µl Vollblut zu 1 ml Ammoniumchloridlyselösung*. Mischen Sie es vorsichtig (durch Umdrehen oder auf einem Tischschüttler) 5 Minuten lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie es anschließend 5 Minuten lang bei 700 × g in einer Mikrozentrifuge.
3. Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie den Rückstand vorsichtig in einem zusätzlichen ml Ammoniumchloridlyselösung, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie wie in Schritt 2. Entsorgen Sie den Überstand, halten Sie den Zellrückstand auf Eis und fahren Sie mit dem Protokoll für Leukozyten (1e) fort.
*Ammoniumchloridlyselösung:
160 mmol/l Ammoniumchlorid (Katalognr.: A9434), 20 mmol/l Natriumbicarbonat (Katalognr.: S7277), pH-Wert auf 7,2 mit HCl.
Vorsichtsmaßnahmen und Haftungsausschluss
Das GenElute™-Kit für genomische Säugetier-DNA ist nur für den Laborgebrauch vorgesehen, nicht für Arzneimittel, Haushalt oder andere Zwecke. Die Lyselösung C enthält ein chaotropes Salz, das ein Reizstoff ist. Die Säulenvorbereitungslösung ist ein Reizstoff. Vermeiden Sie eine Berührung mit der Haut. Tragen Sie Handschuhe, Sicherheitsbrille und geeignete Schutzkleidung, wenn Sie diese Lösungen oder ein in dem Kit bereitgestelltes Reagens handhaben. Informationen zu Gefahren und zur sicheren Handhabung entnehmen Sie bitte dem Sicherheitsdatenblatt (SDB).
Literatur
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