Lise celular e extração de proteínas para Western blot

Todas as etapas para extração de proteínas de células ou tecidos (frescos ou congelados) devem ser realizadas a 2-8 °C. A seguir está a composição de um tampão de lise comum usado para preparar amostras de proteínas. Visite a página Calculadoras para obter uma lista de receitas de tampões e outras soluções de Western blot.

Tampão RIPA para extração de proteínas, solução pronta para uso (Produto nº R0278)

• NaCl (S3014) 150 mM
  
• Triton X-100 (T8787) 1%
  
• Desoxicolato de sódio (D6750) a 0,5%
  
• SDS (74255) 0.1%
  
• Tris-HCl (T1503) pH 8,0, 50 mM

Inibidores de protease – Não perca suas proteínas durante a preparação da amostra

Etapas do protocolo de extração de proteínas

1. Descarte o meio em placas de cultura com células e lave as células usando PBS gelado.
   
2. Descarte o PBS, adicione o tampão de lise gelado.
   
3. Raspe as células usando um raspador de células de plástico frio. Colete as células em tubos de microcentrífuga.
   
4. Agite o conteúdo em tubos de microcentrífuga por 30 min a 4 °C.
   
5. Centrifugue os tubos a 16.000 xg por 20 min a 4 °C. Colete o sobrenadante com um tubo novo e coloque no gelo. Descarte o pélete.

Extração de proteínas de células em suspensão

1. Centrifugue a suspensão celular a 2.000 xg por 5-7 min a 4 °C. As células são coletadas no fundo do tubo, descartando o sobrenadante.
   
2. Ao fracionamento celular, adicione PBS gelado e lave as células por centrifugação a 2.000 xg por 5-7 min a 4 °C.
   
3. Adicione tampão de lise gelado ao pélete de células. Agite o conteúdo em tubos de microcentrífuga por 30 min a 4 °C.
   
4. Centrifugue os tubos a 16.000 xg por 20 min a 4 °C. Colete o sobrenadante com um tubo novo e coloque no gelo. Descarte o pélete.

Extração de proteínas de tecidos

1. Disseque o tecido de interesse no gelo. Transfira o tecido para tubos de microcentrífuga de fundo redondo e congele por imersão em nitrogênio líquido.
   
2. Para tecido de 5 mg, adicione 300 μl de tampão de lise gelado e homogeneize usando homogeneizador elétrico. Adicione 300-600 μl adicionais de tampão de lise durante a homogeneização.
   
3. Agite o conteúdo por 2 horas a 4 °C.
   
4. Centrifugue os tubos a 16.000 xg por 20 min a 4 °C. Colete o sobrenadante com um tubo novo e coloque no gelo. Descarte o pélete.

Normalize a concentração total de proteínas das amostras

1. Pegue um pequeno volume de lisado para realizar o ensaio de estimativa de proteína.
2. Determine a concentração de proteína de amostras desconhecidas por comparação com os padrões, garantindo que o padrão seja diluído no mesmo tampão que as amostras desconhecidas. A estimativa de proteínas pode ser realizada utilizando o reagente de ensaio de proteína de Coomassie (Produto nº 27813), ensaio BCA, absorvância a 280 nm.
3. Transfira o volume apropriado de lisados para tubos de microcentrífuga para que todas as amostras contenham a mesma concentração total de proteína.
   
4. Adicione o tampão de lise gelado adequado para perfazer todos os lisados no mesmo volume.

Misture amostras com o tampão de carregamento de Laemmli

A seguir está a composição do tampão de carregamento necessário para preparar as amostras para eletroforese.

Tampão de carregamento de 2X Laemmli:

• Azul de bromofenol (Produto nº B5525) a 0,004%
• 2-mercaptoetanol a 10%
• Glicerol (Produto nº G5516) a 20%
• SDS (Produto nº 74255) a 4%
• Tris-HCl (Produto nº T1503) a 0,125 M

1. Para um volume de lisado celular, adicione volume igual do tampão de carregamento.
   
2. Ferva a mistura acima a 95 °C por 5 minutos. Centrifugue a 16.000 xg por 5 minutos.
   
3. Estas amostras podem ser armazenadas a -20 °C ou podem ser usadas para prosseguir com eletroforese em gel.