Zelllyse und Proteinextraktion für Western Blotting

Alle Schritte zur Proteinextraktion aus Zellen oder Gewebe (frisch oder gefroren) müssen bei 2–8 °C durchgeführt werden. Nachstehend ist die Zusammensetzung eines gängigen Lysepuffers aufgeführt, der zur Vorbereitung von Proteinproben verwendet wird. Auf der Seite Rechner finden Sie eine Liste mit Rezepturen für Puffer und andere Western-Blotting-Lösungen.

RIPA-Puffer zur Proteinextraktion, gebrauchsfertige Lösung (Produkt-Nr. R0278)

• NaCl (S3014) 150 mM
  
• Triton X-100 (T8787) 1 %
  
• Natriumdesoxycholat (D6750) 0,5 %
  
• SDS (74255) 0,1 %
  
• Tris-HCl (T1503) pH 8,0, 50 mM

Proteaseinhibitoren – Verlieren Sie Ihre Proteine nicht bei der Probenvorbereitung

Schritte des Proteinextraktionsprotokolls

1. Das Medium in den Kulturschalen mit den Zellen verwerfen und die Zellen mit eiskaltem PBS waschen.
   
2. Das PBS verwerfen und eiskalten Lysepuffer hinzufügen.
   
3. Die Zellen mit einem kalten Zellschaber aus Plastik abschaben. Die Zellen in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln.
   
4. Den Inhalt in Mikrozentrifugenröhrchen 30 min bei 4 °C schütteln.
   
5. Die Röhrchen bei 16.000 x g 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand in einem neuen Röhrchen auffangen und auf Eis stellen. Das Pellet verwerfen.

Extraktion von Proteinen aus Zellsuspensionen

1. Die Zellsuspension bei 2000 x g für 5–7 min bei 4 °C zentrifugieren. Die Zellen werden am Boden des Röhrchens gesammelt, der Überstand verworfen.
   
2. Dem Zellpellet eiskaltes PBS zugeben und die Zellen durch Zentrifugieren bei 2000 x g für 5-7 Minuten bei 4 °C waschen.
   
3. Eiskalten Lysepuffer zum Zellpellet geben. Den Inhalt in Mikrozentrifugenröhrchen 30 min bei 4 °C schütteln.
   
4. Die Röhrchen bei 16.000 x g 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand in einem neuen Röhrchen auffangen und auf Eis stellen. Das Pellet verwerfen.

Extraktion von Proteinen aus Geweben

1. Das Gewebe von Interesse auf Eis sezieren. Das Gewebe in Mikrozentrifugenröhrchen mit rundem Boden übertragen und durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff schockgefrieren.
   
2. Für 5 mg Gewebe 300 µl eiskalten Lysepuffer hinzufügen und mit einem elektrischen Homogenisator homogenisieren. Während der Homogenisierung weitere 300-600 µl Lysepuffer hinzufügen.
   
3. Den Inhalt 2 h bei 4 °C schütteln.
   
4. Die Röhrchen bei 16.000 x g 20 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand in einem neuen Röhrchen auffangen und auf Eis stellen. Das Pellet verwerfen.

Normalisierung der Proben-Gesamtproteinkonzentration

1. Eine kleine Menge des Lysats entnehmen, um die Proteinschätzung durchzuführen.
2. Die Proteinkonzentration der unbekannten Proben durch Vergleich mit den Standards bestimmen, wobei der Standard in den gleichen Puffer wie die unbekannten Proben verdünnt werden muss. Die Proteinschätzung kann mit Coomassie-Protein-Assay-Reagenz (Produkt Nr. 27813), BCA-Assay, Absorbanz bei 280 nm durchgeführt werden.
3. Eine angemessene Menge an Lysaten in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, damit alle Proben die gleiche Gesamtproteinkonzentration enthalten.
   
4. Ausreichend eiskalten Lysepuffer zugeben, um alle Lysate auf dasselbe Volumen aufzufüllen.

Proben mit Laemmli-Ladepuffer mischen

Nachstehend die Zusammensetzung des Ladepuffers, der zur Vorbereitung der Proben für die Elektrophorese erforderlich ist.

2X Laemmli-Ladepuffer:

• Bromophenolblau (Produkt-Nr. B5525) 0,004 %
• 2-Mercaptoethanol 10 %
• Glycerin (Produkt-Nr. G5516) 20 %
• SDS (Produkt-Nr. 74255) 4 %
• Tris-HCl (Produkt-Nr. T1503) 0,125 M

1. Einem Volumen Zelllysat das gleiche Volumen Ladepuffer zusetzen.
   
2. Diese Mischung 5 min bei 95 °C kochen. Bei 16.000 x g 5 min zentrifugieren.
   
3. Diese Proben können bei -20 °C gelagert oder für die Gelelektrophorese verwendet werden.