Northern und Southern Blot Protokolle und Einführung

Protokoll für Southern Blotting
Protokoll für Northern Blotting

Worum handelt es sich bei Northern und Southern Blotting?

Der Transfer von Makromolekülen wie Nukleinsäuren und Proteinen auf Festphasenmembranen wird als Blotting bezeichnet. Fragmente von DNA- oder RNA-Molekülen, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt wurden, werden in einem Verfahren, das als Southern bzw. Northern Blotting bezeichnet wird, auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran übertragen. Southern Blotting wurde von Edwin Southern im Jahr 1975 als eine Methode zum Nachweis von spezifischen DNA-Sequenzen in DNA-Proben etabliert. Die anderen aus dieser Methode entwickelten Blotting-Verfahren wurden Northern Blotting (für RNA), Western Blotting (für Proteine), Eastern Blotting (für post-translationale Proteinmodifikationen) und Southwestern Blotting (für DNA-Protein-Interaktionen) genannt.

Die grundlegenden Schritte der Protokolle für Southern und Northern Blotting sind:

• Aufreinigung von DNA/RNA: Extrahieren und reinigen Sie die DNA/RNA aus Zellen oder Gewebeproben.
• DNA-Verdau: Führen Sie einen Restriktionsenzymverdau zur Spaltung der DNA in Fragmente durch. Dieser Schritt ist bei RNA nicht erforderlich.
• Gelelektrophorese: Trennen Sie die DNA-Fragmente im Agarosegel auf. RNA-Proben können mit Formaldehyd als Denaturierungsmittel, das die Sekundärstrukturen der RNA-Moleküle limitiert, in Agarosegelen aufgetrennt werden.
• Transfer: Übertragen Sie die DNA/RNA-Fragmente von dem Gel auf eine Nylonmembran.
• Prähybridisierung (Blockierung): Waschen Sie die Nylonmembran mit einer Prähybridisierungslösung, die Lachssperma-DNA enthält, um unspezifische DNA-Wechselwirkungen zu blockieren und das Hintergrundrauschen zu verringern. Alternativ können Sie PerfectHyb™ Plus Puffer verwenden, bei dem keine Lachssperma-DNA für die Blockierung erforderlich ist.
• Herstellung der Sonde: Stellen Sie frische Sonden-DNA her und markieren Sie diese mit ³²P-alpha-markiertem dCTP.
• Hybridisierung: Inkubieren Sie den Blot mit der markierten Sonde.
• Nachweis der Sonde: Weisen Sie die Sonde und die gewünschte DNA/RNA-Sequenz durch Exposition gegenüber einem Film bei -80 °C nach.

Abbildung 1. Ablauf des DNA/RNA-Blotting-Verfahrens

Protokoll für Southern Blotting

Erforderliche Materialien

• Reagenzien für die DNA-Isolierung und -Aufreinigung
  
• Reagenzien für den DNA-Restriktionsverdau
  
• Reagenzien und Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese
  
• Apparatur für die Agarose-Gelelektrophorese
  
• Whatman Filterpapiere
  
• Papiertücher
  
• Positiv geladene Nylonmembran
  
• Lachssperma-DNA
  
• Hybridisierungsröhrchen
  
• Röntgenfilme
  
  

Erforderliche Puffer

• 10x TBE (93290) wird bei der Gelelektrophorese verwendet. TAE-Puffer (65497) kann anstelle von TBE für größere DNA-Fragmente eingesetzt werden. Alternativ können mit Bionic™ Puffer (B6185) anstelle von TAE oder TBE schärfere Banden in kürzerer Zeit erzielt werden. Sie können den 10x TBE-Puffer aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  TRIS 1,3 M
  Borsäure 450 mM
  EDTA 25 mM
  
  
• 20x SSPE (S2015) wird als Prähybridisierungs- und Transferpuffer verwendet. 20x SSC Puffer (93017) kann anstelle von SSPE in ähnlichen Blotting-Protokollen eingesetzt werden. Alternativ können Sie den 20x SSPE-Puffer aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  NaCl 2,98 M
  EDTA 0,02 M
  Phosphatpuffer (pH 7,4) 0,2 M
  
  
• Denaturierungslösung (N1531) wird verwendet, um die dsDNA zu denaturieren und somit für die Sonde zugänglich zu machen. Alternativ können Sie die 1x Denaturierungslösung aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  NaCl 1,5 M
  NaOH (S5881) 0,5 N
  Stellen Sie den pH-Wert auf ~13 ein.
  
  
• Neutralisierungslösung (N6019) wird verwendet, um das Gel nach der Denaturierung der dsDNA zu neutralisieren. Alternativ können Sie die 1x Neutralisierungslösung aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  NaCl 1,5 M
  TRIS HCl 1 M
  Stellen Sie den pH-Wert auf 7,5 ein
  
  
• * Denhardts Lösung (D2532) wird bei der Prähybridisierung verwendet, um unspezifische DNA-Hybridisierungen zu blockieren. Alternativ können Sie die 50x Denhardts Lösung aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  Rinderserumalbumin (A7906) 1 %
  Ficoll (F2637) 1 %
  Polyvinylpyrrolidon (PVP40) 1 %
  
  Lösen Sie die Komponenten in Wasser, so dass das Endvolumen 50 ml beträgt. Sterilisieren Sie die Lösung durch Filtration.
• * 2x Prähybridisierungslösung (P1415) wird verwendet, um die Membran für die Hybridisierung mit der Sonde vorzubereiten. Alternativ können Sie die 1x Prähybridisierungslösung (100 ml) aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  20x SSPE 30 ml
  100x Denhardts Lösung 10 ml
  10 % SDS 10 ml
  Wasser 50 ml
  
  
• * Hybridisierungslösung (H7140) wird während des Hybridisierungsschritts verwendet. Alternativ können Sie die Hybridisierungslösung (100 ml) aus den folgenden Reagenzien herstellen:
  
  20x SSPE 30 ml
  10 % SDS 10 ml
  Wasser 60 ml
  
  
• 1x Sondenpuffer wird für die Sondenmischung verwendet. (100 µl; frisch herstellen):
  
  1 M TRIS, pH 7,6 50 µl
  2 M MgCl₂ 5 µl
  0,5 M DTT 10 µl
  Wasser 35 µl
  
  
• 1x Sondenmischung (27 µl):
  
  Sondenpuffer 2,7 µl
  Oligonukleotidsonde (0,2 µg/µl) 2 µl
  T4-Phosphonukleotidkinase (PNK) 1 µl
  Wasser 11,3 µl
  ³²P-ATP 10 µl
  
  
• 6x niedrig-stringente Waschlösung wird verwendet, um Hybridisierungen mit geringer Homologie zu entfernen und das Hintergrundrauschen zu verringern. Stellen Sie 600 ml Waschlösung aus den folgenden Reagenzien her:
  
  20x SSPE 180 ml
  10 % SDS 12 ml
  Wasser 408 ml
  
  
• 1x hoch-stringente Waschlösung wird verwendet, um eng homologe Hybridisierungen zu entfernen und das Hintergrundrauschen weiter zu verringern. Stellen Sie 600 ml Waschlösung aus den folgenden Reagenzien her:
  
  20x SSPE 30 ml
  10 % SDS 12 ml
  Wasser 558 ml

* PerfectHyb™ Plus Hybridisierungspuffer (H7033) kann anstelle von Denhardts Lösung, Prähybridisierungs- und Hybridisierungslösung verwendet werden. PerfectHyb™ Puffer ist dafür optimiert, ein maximales Signal mit minimalem Hintergrund bei einer Hybridisierungsdauer von nur 1–2 Stunden zu erzeugen. PerfectHyb™ Plus wurde so formuliert, dass dieser Puffer mit jedem Hybridisierungsprotokoll, mit jedem Sondentyp und mit jedem Membrantyp (positiv geladene oder neutrale Nylon- und Nitrocellulosemembran) eingesetzt werden kann.

DNA-Isolierung

Sigma-Aldrich bietet GenElute™ Kits zur Isolierung von DNA aus Pflanzen und Pilzen (E5038), aus Säugetierzellen oder -gewebe (G1N70, G1N10 und G1N350) sowie aus Blut (NA2010 und NA2020) an. Das detaillierte Protokoll für die DNA-Isolierung mit den GenElute™ Kits finden Sie hier.

Zusätzlich können DNAstable^® Kits (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML und 93121-017-1EA) für den Fall eingesetzt werden, dass die DNA versendet oder bei Raumtemperatur aufbewahrt und stabilisiert werden soll.

Restriktionsverdau

Führen Sie den Verdau der DNA-Probe mit einem geeigneten Restriktionsenzym für 2–24 h bei 37 °C durch. Wenn die DNA-Probe klonal erzeugt wurde, ist eine Inkubationszeit für den Verdau von 1–2 h ausreichend. Bei genomischer DNA ist generell eine Inkubation über Nacht mit überschüssigem Enzym (5–10 x) erforderlich.

Falls notwendig, konzentrieren Sie die verdaute DNA durch Ethanolausfällung an. Vorhandene Ethanolreste müssen vollständig entfernt werden, bevor die DNA auf dem Gel aufgetrennt wird.

Gelelektrophorese

Trennen Sie die verdaute DNA im Agarosegel auf. TAE sollte für kürzere Läufe (<4 Std.) sowie größere DNA-Fragmente und TBE für längere Läufe (>4 Std.) sowie kleinere DNA-Fragmente (<1 kb) eingesetzt werden. Für schärfere Bandenauflösung in kürzerer Zeit als mit TAE oder TBE können Sie alternativ Bionic™ Puffer (B6185) verwenden (weitere Informationen finden Sie in den Daten für den Bionic™ Puffer). Färben Sie das Gel mit Ethidiumbromid und erzeugen Sie das Bild des Gels mit einem UV-Transilluminator. Wenn Ethidiumbromid bereits vor der Gelelektrophorese zu der Agarose hinzugefügt wurde, kann das Bild des Gels sofort nach der Elektrophorese erzeugt werden.

Transfer

Während des Transfer-Schritts wird die DNA (oder RNA) von dem Elektrophoresegel auf eine Nylonmembran übertragen, so dass sie mit einer Sonde hybridisiert und nachgewiesen werden kann.

• Legen Sie das Gel in eine flache Schale mit ausreichend Denaturierungslösung, so dass das Gel vollständig damit bedeckt ist. Waschen Sie das Gel zweimal mit dieser Lösung, jeweils 25 min lang auf einem Schüttler.
  
• Waschen Sei das Gel zweimal mit Wasser.
  
• Waschen Sie das Gel zweimal mit Neutralisierungslösung, jeweils 15 min lang auf einem Schüttler.
  
• Waschen Sei das Gel zweimal mit Wasser.
  
• Waschen Sie das Gel mit 20x SSPE 30 min lang auf einem Schüttler.
  
• Bereiten Sie während des Waschens das Whatman-Papier und die Membran für den Transfer vor.
  
• Schneiden Sie einen Streifen von der Nylonmembran ab (15356) und lassen sie in Wasser einweichen. Schneiden Sie einen Streifen Whatman-Papier, der breiter als das Gel ist, ab und weichen ihn in 10x SSPE-Puffer (Transferpuffer) ein.
  
• Schneiden Sie drei Streifen Whatman-Papier ab, die ungefähr dieselbe Größe wie das Gel haben.
  
• Schneiden Sie mehrere Papiertücher etwa in derselben Größe wie das Gel zurecht.
  
• Platzieren Sie eine stabile Platte in einer flachen Schale mit 10x SSPE.
  
• Legen Sie ein Stück Frischhaltefolie auf die Platte. Legen Sie ein mit 10x SSPE getränktes Whatman-Papier auf die Frischhaltefolie. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, indem Sie einen Glasstab über den Stapel rollen und die Luftblasen dadurch entfernen. Überprüfen Sie, dass die Ränder des Whatman-Papiers in den SSPE-Puffer in der Schale eintauchen. Dieses Stück Whatman-Papier wirkt als Docht, der den SSPE-Puffer nach oben und durch das Gel zieht, so dass die DNA-Banden auf der Nylonmembran abgeschieden werden.
  
• Platzieren Sie das Gel mit der Oberseite nach unten auf dem nassen Whatman-Papier. Legen Sie die Membran auf das Gel. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, indem Sie einen Glasstab über den Stapel rollen und die Luftblasen dadurch entfernen.
  
• Legen Sie drei Streifen Whatman-Papier auf die Membran. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, indem Sie einen Glasstab über den Stapel rollen und die Luftblasen dadurch entfernen.
  
• Legen Sie einen Stapel Papiertücher und zum Schluss ein Gewicht (z. B. eine Glasplatte) darauf.
  
• Lassen Sie diesen Versuchsaufbau über Nacht stehen, damit die DNA-Fragmente vollständig übertragen werden. Der Transfer von DNA-Fragmenten bis 15 kb dauert ungefähr 18 Stunden.
  
• Wenn der Transfer abgeschlossen ist, legen Sie den Blot auf einen auf Automatik gestellten UV-Vernetzer (UV-Crosslinker). Die Vernetzung mit UV wird durchgeführt, um die DNA oder RNA kovalent an die Nylonmembran zu binden, wodurch die Hybridisierungssignale während des Nachweises verstärkt werden. Eine andere Möglichkeit ist, die trockene Membran nach dem Transfer zu „backen“, was zu einer nicht-kovalenten, jedoch semi-permanenten Bindung der Nukleinsäuren an die Membran führt. DNA kann nicht durch UV mit einer Nitrocellulosemembran vernetzt werden, sondern muss gebacken werden.

Abbildung 2. Southern-/Northern-Blot-Versuchsaufbau für den Transfer

Prähybridisierung (Blockierung)

Der Prähybridisierungsschritt (auch Blockierung genannt) wird durchgeführt, um die unspezifische Anhaftung der Sonde an die Nylonmembran zu minimieren. Häufig wird Lachssperma-DNA als Blockierungsmittel eingesetzt, um zu verhindern, dass die Sonde an der Membran haftet, sodass sichergestellt ist, dass die Sonde nur mit den gewünschten DNA-Banden interagiert, die auf die Membran übertragen worden sind. Stellen Sie die Prähybridisierungslösung wie im Folgenden beschrieben her oder verwenden Sie PerfectHyb™ Plus Puffer (H7033):

• Erwärmen Sie die Prähybridisierungslösung auf 42 °C.
  
• Erhitzen Sie eine Probe der Lachssperma-DNA (D9156) 5 min lang auf 95 °C und kühlen sie anschließend sofort auf Eis ab.
  
• Fügen Sie die Lachssperma-DNA zu der warmen Prähybridisierungslösung dazu, so dass die Endkonzentration der Lachssperma-DNA 50 µg/ml beträgt.
  
• Nehmen Sie den Blot aus dem UV-Vernetzer und stecken ihn vorsichtig gerollt in ein Hybridisierungsröhrchen.
  
• Geben Sie die Prähybridisierungslösung mit der Sperma-DNA in das Hybridisierungsröhrchen und platzieren Sie es bei 42 °C für 5 Stunden in dem Hybridisierungsofen.

Hybridisierung

Ein komplementärer DNA-Strang (eine Sonde) dient zum Nachweis der gewünschten Sequenz, die auf der Membran vorhanden sein sollte. Die DNA-Stränge aus zwei verschiedenen Quellen ergeben zusammen eine „hybride“ dsDNA, aber nur dann, wenn die Stränge homolog sind.

• Stellen Sie die 1x Sondenmischung her und inkubieren sie 40 Minuten lang bei 37 °C im Wasserbad.
  
• Die freie Markierung (nicht eingebaute Sonde) kann entfernt werden, indem Sie die Sonde durch eine G-25-Sephadex-Säule laufen lassen.
  
• Bestimmen Sie die spezifische Aktivität der Sonde mit Flüssigszintillation.
  
• Erwärmen Sie 10 ml der Hybridisierungslösung auf 49 °C, fügen Sie 10–15 x 10⁶ cpm der Sonde hinzu und mischen Sie gründlich.
  
• Entfernen und entsorgen Sie die Prähybridisierungslösung von dem Blot. Fügen Sie die Hybridisierungslösung mit der markierten Sonde hinzu. Inkubieren Sie bei 49 °C über Nacht.
  Hinweis: Alternativ können Sie PerfectHyb™ Plus Puffer (H7033) für die Hybridisierung verwenden, wodurch in viel kürzerer Zeit ein stärkeres Signal erzeugt wird. Weitere Informationen zum Protokoll und den Daten finden Sie im PerfectHyb™ Plus Protokoll.
  
• Erwärmen Sie die 6x Waschlösung auf 49 °C. Entfernen und entsorgen Sie die Hybridisierungslösung von dem Blot und fügen Sie die 6x Waschlösung hinzu.
  
• Erwärmen Sie die 6x niedrig-stringente Waschlösung auf 49 °C. Entfernen und entsorgen Sie die Hybridisierungslösung von dem Blot und fügen Sie die 6x Waschlösung hinzu. Durch die niedrig-stringente Waschlösung werden Hybridisierungen mit geringer Homologie entfernt und Wechselwirkungen mit hoher Homologie bleiben erhalten, wodurch die Hybridisierung mit der gewünschten DNA-Probe präzisiert wird.
  
• Stellen Sie die 1x hoch-stringente Waschlösung her und erwärmen Sie auf 49 °C. Waschen Sie den Blot ungefähr 30 Sekunden lang und entsorgen Sie die Waschlösung. In diesem Schritt wird die Hybridisierung mit der gewünschten DNA durch eine hoch-stringente Waschlösung weiter präzisiert, indem eng homologe Hybridisierungen entfernt werden.
  
• Überprüfen Sie die Aktivität des Blots mit einem Geigerzähler. Wünschenswert sind 10–50 Zählimpulse pro Sekunde bei den Banden mit den höchsten Strahlungswerten. Wenn der Hintergrund zu stark ist, waschen Sie den Blot noch einmal mit 1x Waschlösung.

Nachweis der Sonde

• Platzieren Sie den Blot in einer mit einem neuen Stück Frischhaltefolie ausgekleideten Filmkassette. Wickeln Sie den Blot vorsichtig ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen zwischen dem Blot und der Folie eingeschlossen werden.
  
• Bringen Sie die Kassette in die Dunkelkammer und legen Sie den Röntgenfilm auf den Blot. Verschließen Sie die Kassette und bewahren Sie diese bei -80 °C über Nacht auf. Entwickeln Sie den Film am folgenden Tag.
  
• Auf den Blot kann ein weiterer Röntgenfilm gelegt werden und für eine weitere Exposition wieder bei -80 °C aufbewahrt werden.

Protokoll für Northern Blotting

Das Protokoll für Northern Blotting ist ähnlich wie das für Southern Blotting. Die RNA-Sequenzen werden jedoch in einem denaturierenden Agarosegel aufgetrennt, das Formaldehyd enthält.

RNA-Isolierung

• Isolieren Sie die RNA aus Zellen oder Gewebeproben mit dem TRI Reagent^® (T9424) oder dem GenElute™ Kit für Säugetierzellen oder Gewebe (RTN70, RTN10 und RTN350).
  
• Lesen sie die Absorption der Proben bei 260 nm und 280 nm ab, um die Qualität und die Konzentration der RNA zu bestimmen. Ein Verhältnis der Absorption A₂₆₀/A₂₈₀ von 1,8–2,1 zeigt eine gute RNA-Qualität an.

Gelelektrophorese

• Laden Sie die Proben vorsichtig mithilfe von Pipetten in die Geltaschen. Bei Bedarf kann auch ein geeigneter Marker mit RNA-Fragmenten verschiedener Größen (R7020, R7644) geladen werden.
  
• Ein detailliertes Protokoll für die Denaturierung von RNA mit Agarose-Gelelektrophorese finden Sie unter Introduction to Nucleic Acid Electrophoresis
  

Wenn Ethidiumbromid bereits vor der Gelelektrophorese zu der Agarose hinzugefügt wurde, kann das Bild des Gels sofort nach der Elektrophorese erzeugt werden.

Transfer

Die Protokolle für den Transfer-Versuchsaufbau, die Prähybridisierung, die Hybridisierung und den Nachweis sind dieselben wie beim Southern Blotting.

Literaturhinweis

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press.