Universelles SYBR Green qPCR-Protokoll

Technologieüberblick
Zu berücksichtigende Assay-Aspekte
Quantifizierungsmethoden
Ausrüstung & Zubehör
PCR-Mix-Auswahlhilfe
Protokoll
Fehlerbehebung
Materialien
Referenzen

Technologie-Überblick: SYBR Green qPCR

Mit der Entwicklung von Thermocyclern mit Fluoreszenzdetektion hat die PCR einen neuen, innovativen Einsatzbereich gefunden. Bei der Routine-PCR ist das entscheidende Ergebnis die finale Amplikonmenge, die nach dem Prozess erzeugt wird. In der Echtzeit- oder quantitativen PCR (qPCR) wird die Linearität der DNA-Amplifikation genutzt, um absolute oder relative Mengen einer bekannten Sequenz in einer Probe zu bestimmen. Durch die Verwendung eines fluoreszierenden Reporters in der Reaktion ist es möglich, die DNA-Erzeugung zu messen.

Abbildung 1. Technologie-Überblick: SYBR Green qPCR

Bei der quantitativen PCR wird die DNA-Amplifikation bei jedem Zyklus der PCR überwacht. Wenn sich die DNA in der logarithmischen Phase der Amplifikation befindet, steigt die Fluoreszenzmenge über den Hintergrund an. Der Punkt, an dem die Fluoreszenz messbar wird, wird als Quantifizierungszyklus (C_q) oder Kreuzungspunkt bezeichnet. Durch die Verwendung mehrerer Verdünnungen einer bekannten Menge Standard-DNA kann eine Standardkurve der logarithmischen Konzentration gegen den C_q erstellt werden. Die Menge an DNA oder cDNA in einer unbekannten Probe kann dann anhand ihres C_q-Werts berechnet werden.

A) Die verschiedenen Phasen der Reaktion:
Basislinie: Die Anfangskonzentration des Templates ist niedrig; daher ist die Fluoreszenzintensität zu gering, um nachgewiesen zu werden, und nur das Hintergrundsignal ist evident.
Exponential: Nachdem die Zielausbeute die Nachweisgrenze erreicht hat, die als rote Schwellenlinie dargestellt ist, kann der Verlauf der Reaktion durch die Exponentialphase verfolgt werden.
Linear: Mit zunehmender Konzentration des Templates nimmt die verfügbare DNA-Polymerase-Konzentration ab und die Reaktionsgeschwindigkeit sinkt.
Plateau: Es ist nicht genügend freies Enzym vorhanden, um die Amplifikation fortzusetzen, sodass die Reaktion nach diesem Punkt die maximale Ausbeute oder die Plateauphase erreicht hat.

B) Einzelne Reaktionen werden durch den Zyklus charakterisiert, bei dem die Fluoreszenz erstmals über den Schwellenwert ansteigt, was als Quantifizierungszyklus (C_q) bezeichnet wird. Wenn das Ausgangsmaterial reichlich vorhanden ist, wird die Amplifikation in früheren Zyklen beobachtet und der C_q-Wert ist niedriger. Wenn das Ausgangsmaterial knapp ist, wird die Amplifikation in späteren Zyklen beobachtet, und der C_q-Wert ist höher. Diese Korrelation zwischen Fluoreszenz, C_q und der Menge des amplifizierten Produkts ermöglicht die Quantifizierung des Templates über einen breiten dynamischen Bereich.

Die Echtzeit-PCR eignet sich auch für relative Studien. Eine Reaktion kann mit Primern durchgeführt werden, die für jede zu amplifizierende Region einzigartig sind und mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Verschiedene im Handel erhältliche quantitative Thermocycler verfügen über mehrere Detektionskanäle. In diesem Multiplex-System kann die Menge der Ziel-DNA/-cDNA mit der Menge einer Housekeeping-Sequenz, z. B. GAPDH oder β-Actin, verglichen werden.

SYBR Green qPCR-Anwendungen
Massen-Screening	XX
Microarray-Validierung	XX
Mehrere Zielgene/wenige Proben	X
SNP-Nachweis	NE
Allelische Diskriminierung	NE
Pathogennachweis	X
Multiplexing	NE
Quantifizierung der Viruslast	NE
Analyse der Genexpression	X
Bestimmung der Genkopien	NE
Endpunkt-Genotypisierung	NE
In vitro-Quantifizierung	NE

NR= nicht empfohlen
X= empfohlen
XX= bevorzugte Methode

Überlegungen zum Assay

DNA-Präparation

Der wichtigste Schritt für die Sicherstellung des Erfolgs der PCR ist eine qualitativ hochwertige DNA-Präparation. Integrität und Reinheit der DNA-Templates sind von entscheidender Bedeutung. Die quantitative PCR umfasst mehrere Runden enzymatischer Reaktionen und ist daher empfindlicher gegenüber Verunreinigungen wie Proteinen, Phenol/Chloroform, Salzen, EDTA und anderen chemischen Lösungsmitteln. Auch Verunreinigungen können den Fluoreszenznachweis stören. Das Verhältnis der Absorbanzwerte bei 260 nM und 280 nM ergibt einen Schätzwert für die DNA-Reinheit. Reine DNA hat ein A260/A280-Verhältnis von 1,8-2,0. Niedrigere Werte weisen auf das Vorhandensein von Verunreinigungen wie Proteine hin.

Template

Für die qPCR werden nur sehr wenige Kopien der Zielnukleinsäure benötigt (das entspricht etwa 100 pg gDNA oder cDNA). Zur Minimierung der Kontamination mit Reaktionsinhibitoren soll die Ausgangsmenge des Templates so gering gehalten werden, dass eine genaue Quantifizierung möglich ist. Handelt es sich beim Ausgangsmaterial um RNA, werden durch Primerdesign und DNase I-Behandlung Signale, die durch gDNA-Kontamination entstehen können, reduziert.

Primer-Planung

Unabhängig davon, ob ein dsDNA-bindender Farbstoff oder eine sondenbasierte Nachweischemie verwendet wird, ist die Entwicklung qualitativ hochwertiger Primer einer der wichtigsten Schritte vor dem Experimentieren unter Einsatz von qPCR. Spezifische Primer für die PCR sollen mit Hilfe einer Primer-Design-Software entworfen werden, um Komplikationen durch Primer-Dimere und Sekundärstrukturen zu vermeiden. Niedrigere Primerkonzentrationen verringern die Bildung von Primer-Dimeren und die Bildung unspezifischer Produkte, was bei der Verwendung des SYBR Green I-Farbstoffs in der quantitativen PCR entscheidend ist.

dNTP

Standard PCR/qPCR-Mastermischungen enthalten dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Es sind jedoch einige Mischungen erhältlich, in denen dTTP durch dUTP ersetzt werden. Produkte aus früheren Reaktionen, die mit dUTP durchgeführt wurden, enthalten Uracil anstelle von Thymin. Diese sind dann anfällig für die Spaltung durch Uracil-DNA-Glykosylase (UNG). Daher verhindert die vorherige Inkubation nachfolgender Reaktionen mit UNG eine Verschleppung von Kontaminationen zwischen den Reaktionen. Um effektiv zu sein, müssen in allen Reaktionen im Labor dUTP verwendet werden.

Magnesiumkonzentration

Magnesiumchlorid (MgCl₂) ist für die Aktivität der reversen Transkriptase, der Taq-DNA-Polymerase und der Taq-DNA-5'-3'-Exonuklease erforderlich. Die optimale Mg²⁺-Konzentration für Reaktionen, die DLP enthalten, liegt in der Regel zwischen 3 – 6 mM. Niedrigere Magnesiumchlorid-Konzentrationen führen in der Regel zur Bildung weniger unspezifischer Produkte. Einige ReadyMix-Lösungen werden in einer 2 X Konzentration von 7 mM Magnesiumchlorid (Endkonzentration 3,5 mM) geliefert. In einigen Fällen wird ein Fläschchen mit einer 25 mM-Magnesiumchloridlösung mitgeliefert, um die endgültige Magnesiumchloridkonzentration ggf. weiter zu optimieren. Eine Reaktionsmischung, die kein MgCl₂ enthält, kann manchmal erforderlich sein, damit eine niedrige Konzentration verwendet werden kann, z. B. bei der Verwendung der Scorpions-Sonde für den Nachweis.

Reverse Transkriptase

Ein Reverse-Transkriptase-Enzym, das eine hohe Ausbeute an cDNA liefert und auch bei hohen Temperaturen aktiv bleibt, ist entscheidend für den Erfolg der RT-qPCR. Die Durchführung bei hohen Temperaturen trägt dazu bei, dass RNA-Regionen mit signifikanter Sekundärstruktur destabilisiert werden und für die Hybridisierung und anschließende Amplifikation zugänglich sind. Bei der einstufigen RT-qPCR ermöglicht die Hochtemperaturleistung die Verwendung genspezifischer Primer mit hoher Schmelztemperatur (T_m), wodurch die Reaktionsspezifität erhöht wird. Bei der Durchführung von zweistufigen Protokollen muss sichergestellt werden, dass das Enzym zu einer linearen und proportionalen Ausbeute von cDNA aus RNA führt. Eine Minimierung des Pipettierens kann die Variabilität verringern. Einige ReadyMixes enthalten Primer und andere Reagenzien, die zur Durchführung von RT benötigt werden, z. B. ReadyScript^® Mix für die cDNA-Synthese (RDRT).

Taq-DNA-Polymerase

Wie bei der Auswahl der am besten geeigneten reversen Transkriptase für die RT ist auch die Auswahl des geeigneten Enzyms entscheidend. Ein grundlegendes Problem der natürlichen Taq-DNA-Polymerase besteht darin, dass das Enzym bei niedrigen Temperaturen eine Restaktivität aufweist. Die unspezifische Primerbindung führt zu einer unspezifischen Produktbildung als Ergebnis dieser Restpolymeraseaktivität. Mit Antikörpern blockierte oder chemisch blockierte Taq-DNA-Polymerasen ("Hot-Start") tragen dazu bei, diese Situation zu korrigieren, indem sie die Enzymaktivität bis zum Beginn des Denaturierungsschritts bei hohen Temperaturen verhindern. Die beste Hot-Start-Polymerase für Ihre Anwendung finden Sie in der Auswahlhilfe zum PCR-Mix.

Interner Referenzfarbstoff nach Instrumententyp

Einige Echtzeit-PCR-Thermocycler erfordern einen Ladefarbstoff wie ROX, um Schwankungen im optischen System auszugleichen und Unterschiede in der Signalintensität zu normalisieren. Ebenso benötigen einige Thermocycler Fluorescein, um einen virtuellen Hintergrund zu erzeugen, wenn mit SYBR Green I-Farbstoffassays gearbeitet wird (die einen sehr niedrigen Hintergrund haben). Diese können im ReadyMix oder als separate Komponenten geliefert werden, sodass die entsprechende Konzentration verwendet werden kann. In einigen Fällen ist ein Fläschchen mit internem Referenzfarbstoff für die Reaktionsnormalisierung enthalten. Die maximale Anregung dieses Farbstoffs liegt bei 586 nM und die maximale Emission bei 605 nM. Die Standardgeräteeinstellungen für den ROX-Referenzfarbstoff sind für die Messung des internen Referenzfarbstoffs ausreichend. Dieser interne Referenzfarbstoff ist für ABI-Sequenz-Nachweissysteme erforderlich.

Geräte

Es müssen Reagenzien ausgewählt werden, die mit den Geräten kompatibel sind. Auf den Plattformen werden unterschiedliche Normalisierungsfarbstoffe verwendet, sodass Reagenzien mit kompatiblen Normalisierungsfarbstoffen ausgewählt werden müssen (siehe Anhang 1).

Viele qPCR-Geräte wurden für einen bestimmten Anwendungsbereich entwickelt, wie z. B. das ABI 7900 für hohen Durchsatz mit automatischem Laden von 384-Well-Platten im Vergleich zum Illumina Eco, das eine einzelne 48-Well-Platte unterstützt. Das am besten geeignete Gerät entspricht den Anforderungen der Forschung. Es ist von Vorteil, ein Gerät mit benutzerfreundlicher Software auszuwählen, das die meisten gewünschten Funktionen ausführen kann und flexibel in der Datenausgabe ist, sodass die Daten in Softwarepaketen für die statistische Analyse im Downstream-Prozess leicht bearbeitet werden können. Dies verkürzt die Zeit, die für die Schulung von Mitarbeitern und damit für das Erreichen von Ergebnissen erforderlich ist. Zu den weiteren erforderlichen Merkmalen gehören ein PCR-Block, der absolut einheitlich ist (eine absolute maximale Abweichung von 1C_q = 2-fach über 96-Well-Replikation) und ein optisches System, das die Emission so empfindlich und gleichmäßig wie möglich über einen breiten Wellenlängenbereich anregt und nachweist. Dies erlaubt eine große Auswahl an Fluorophoren und ermöglicht Multiplexing. Weitere zu berücksichtigende Merkmale sind die Betriebskosten, die mit spezifischen Verbrauchsmaterialien einhergehen, wenn z. B. für die Reaktionen keine Standard-Mikrotiterplatte verwendet wird, und auch der Nutzen von Platten/Röhrchen, die nicht dem Standardformat entsprechen.

Kontrollen

Eine Positivkontrolle ist immer hilfreich, um sicherzustellen, dass alle Komponenten des Kits ordnungsgemäß funktionieren. Um festzustellen, ob eine Kontamination vorliegt, ist eine Kontrolle ohne Template/Negativkontrolle erforderlich. Ein Signal in der Negativkontrolle zeigt das Vorhandensein einer DNA-Kontamination oder einer Primer-Dimer-Bildung auf.

Puffer

Puffer oder Reaktions-Mastermischungen enthalten in der Regel dNTP, eine Taq-DNA-Polymerase, MgCl₂ und Stabilisatoren. SYBR Green I, ROX™, Fluorescein und inerte Ladefarbstoffe können abhängig von der Nachweischemie, dem Gerät und den Reaktionsanforderungen ebenfalls enthalten sein. Die Komponenten des PCR-Puffers und die Stabilisatoren sind in der Regel herstellerspezifisch. Bei separatem Kauf ist maximale Flexibilität möglich, da jeder Inhaltsstoff individuell in der Reaktion optimiert werden kann. Obwohl die gebündelte Beschaffung der Inhaltsstoffe als Mastermix die Flexibilität verringert, erhöht sie im Gegenzug die Chargenkonstanz und damit den Nutzen durch die Reduzierung der Anzahl der Pipettierschritte und die Gefahr von Fehlern und Kontaminationen.

Datenanalyse.

Befolgen Sie die Empfehlungen des Echtzeitgeräts, das zur Durchführung der quantitativen SYBR Green PCR verwendet wird. Die folgenden Informationen sind für die Unterstützung neuer Gerätebenutzer ausgelegt. Im Allgemeinen wird die Anzahl der Zyklen im Vergleich zur Fluoreszenz dargestellt. Zur Bestimmung der Template-Menge in jeder Probe werden Schwellenwertzyklen (C_Ts) oder Kreuzungspunkte eingesetzt. Der Schwellenwertzyklus oder Kreuzungspunkt ist der erste Zyklus, in dem ein nachweisbarer Anstieg der Fluoreszenz aufgrund der Bildung von PCR-Produkten dargestellt wird. Die Zyklen vor dem Kreuzungspunkt sind die Grundlinienzyklen. Die Grundlinienzyklen zeigen keinen nachweisbaren Anstieg der Fluoreszenz durch die PCR-Produkte auf. Der Schwellenwert, mit dem bestimmt wird, wann der erste nachweisbare Anstieg der Fluoreszenz auftritt, kann auch manuell angepasst werden. Der Schwellenwert soll immer anhand eines logarithmischen Amplifikationsdiagramms ermittelt werden. In einem logarithmischen Amplifikationsdiagramm soll der Schwellenwert im Log-linearen Bereich und nicht in der Plateauphase festgelegt werden.

Schmelzkurven

Die Durchführung einer Schmelzkurvenanalyse am Ende des Laufs unterstützt dabei, ausschließlich das PCR-Produkt von Interesse zu analysieren. Befolgen Sie die Anweisungen des Echtzeitgeräteherstellers für die Schmelzkurvenanalyse. Aufeinanderfolgende Läufe mit den gleichen Primern können so modifiziert werden, dass der Beitrag der Primer-Dimer-Bildung zum Produktsignal entfernt wird, indem Daten in einem zusätzlichen Zyklusschritt gesammelt werden, dessen Temperatur zwischen den bereits bestimmten Dimer- und Produktschmelztemperaturen (T_Ms) liegen muss.

Methoden der Quantifizierung

Standardkurven

Standardkurven sind sowohl für die absolute als auch für die relative Quantifizierung erforderlich. Bei der Erstellung von Standardkurven sollen verschiedene DNA-Konzentrationen (in der Regel fünf) verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen, welche die Konzentration der Unbekannten einschließt. Jede Konzentration soll in doppelter Ausführung durchgeführt werden.

Absolute und relative Quantifizierung

Dieses SYBR Green PCR-Kit kann zur Quantifizierung der Ziel-DNA entweder durch absolute oder relative Quantifizierung verwendet werden. Absolute Quantifizierungstechniken werden verwendet, um die Menge der Ziel-DNA in der Ausgangsprobe zu bestimmen, während in der relativen Quantifizierung das Verhältnis zwischen der Menge der Ziel-DNA und einem Referenzamplikon ermittelt wird. Das ideale Referenzamplikon hätte eine unveränderliche, konstitutive Expression. In der Praxis wird ein Haushaltsgen für diese Funktion gewählt, aber es gibt auch andere Referenzgene, die den vorgenannten Anforderungen besser entsprechen.¹

Bei der absoluten Quantifizierung werden externe Standards verwendet, um die absolute Menge der Zielnukleinsäure von Interesse zu bestimmen. Um die durch Hybridisierung bedingten Quantifizierungsunterschiede zu beseitigen, müssen die Primer-Bindungsstellen der externen Standards mit denen der Zielsequenz übereinstimmen. Der ideale externe Standard enthält Sequenzen, die mit der Zielsequenz identisch sind oder nur geringfügig von der Zielsequenz abweichen. Für eine absolute Quantifizierung sind äquivalente Amplifikationseffizienzen zwischen dem Ziel und dem externen Standard erforderlich. Sobald ein geeignetes Konstrukt oder Amplikon identifiziert ist, wird eine Standardkurve aus externen Standardverdünnungen erstellt und zur Bestimmung der Konzentrationen unbekannter Zielproben verwendet.

Die relative Quantifizierung ermöglicht die Berechnung des Verhältnisses zwischen der Menge des Ziel-Templates und eines Referenz-Templates in einer Probe. Da bei dieser Methode die Menge des Zielmoleküls im Verhältnis zu einer vermutlich unveränderlichen Kontrolle gemessen wird, wird die relative qPCR am häufigsten verwendet, um Unterschiede im genetischen Polymorphismus zu messen, z. B. zwischen Geweben oder zwischen Proben aus gesundem und erkranktem Gewebe. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass durch die Verwendung eines internen Standards die Schwankungen bei der Probenvorbereitung und -handhabung minimiert werden können. Bei Verwendung von SYBR-Systemen müssen die Quantifizierungen des Ziels und der internen Referenz in getrennten Reaktionen durchgeführt werden.

Die Genauigkeit der relativen Quantifizierung hängt von der Wahl eines geeigneten Referenztemplates für die Standards ab. Die Variabilität des Standards beeinflusst die Ergebnisse, weshalb es sehr wichtig ist, dass die Standards geeignet sind.¹ Einige Forscher verzichten auf die Erstellung einer Standardkurve und geben die Zielmengen als Bruchteil der Referenzmenge an. Dies wird als vergleichende Quantifizierung bezeichnet. Alternativ kann davon ausgegangen werden, dass die Amplifikationseffizienzen von Ziel- und Referenz vernachlässigbar sind, und die Quantifizierung des Ziels ausschließlich auf der Grundlage der für die Referenzsequenz bestimmten Standardkurve vorgenommen werden. Bei der genauesten der relativen Quantifizierungstechniken werden schließlich die Amplifikationseffizienzen sowohl der Referenz als auch des Ziels gemessen und ein Korrekturfaktor bestimmt. Dieser Prozess, der als Normalisierung¹ bezeichnet wird, erfordert eine Probe, die bekannte Konzentrationen von Ziel- und Referenz enthält, sowie die Erstellung von zwei Standardkurven.

Bestimmung der PCR-Reaktionseffizienzen

Die PCR-Effizienz zwischen einer Referenzprobe und einer Zielprobe wird bestimmt, indem für jedes Ziel eine Verdünnungsreihe erstellt wird. Die CT-Werte der Referenz werden vom Ziel subtrahiert und die Differenz der CT-Werte wird im Vergleich zum Logarithmus der Template-Menge dargestellt. Wenn die resultierende Steigung der Geraden weniger als ± 0,1 beträgt, wird davon ausgegangen, dass die Amplifikationseffizienzen ähnlich sind.

Ausrüstung

• Gerät für die quantitative PCR
• Mikrozentrifuge
• Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional)

Materialien

• qPCR SYBR Green Mix – siehe qPCR-Auswahlhilfe (Teil 1 und Teil 2)
• DNA/cDNA-Template – cDNA-Reaktion verdünnt im Verhältnis 1:10 zum Nachweis mittel bis hoch exprimierter Ziele oder 1:2 bis 1:5 für seltene Transkripte oder 10 ng bis 100 ng gDNA
• Vorwärts- und Rückwärtsprimer auf Arbeitskonzentration verdünnt (10 µM Arbeitslösung sind für die meisten Assays ausreichend)
  • Vorgefertigte Primer für die Genexpression sind auch für die meisten Modellorganismen erhältlich (KiCqStart^® SYBR^® Green Primer, KSPQ12012)
• Sterile Filter-Pipettenspitzen
• Sterile 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (z. B. CLS430909)
• PCR Röhrchen; wählen Sie Röhrchen, die dem gewünschten Format entsprechen:
  • Einzelne dünnwandige 200-µl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
  • Platten
    • 96-Well-Mikrotiterplatten (Z374903)
    • 384-Well-Mikrotiterplatten (Z374911)
  • Plattenabdichtungen
    • ThermalSeal RTS™-Dichtungsfolien (Z734438)
    • ThermalSeal RT2RR™-Folie (Z722553)
• Wasser in PCR-Qualität (W1754)

SYBR Green PCR-Mix-Auswahlhilfe – Teil 1

Vollständige ReadyMixes mit Hot Start (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2)
Kompatible Geräte: Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad MiniOpticon™ BioRad MyiQ™ Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler™ 480	Kompatible Geräte: Applied Biosystems 7500 Applied Biosystems 7500 Fast Applied Biosystems ViiA 7 Stratagene Mx3000P® Stratagene Mx3005P™ Stratagene Mx4000™	Kompatible Geräte: Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™	Kompatible Geräte: BioRad iCycler iQ™ BioRad iQ™5 BioRad MyiQ™	Kompatible Geräte: Applied Biosystems 5700 Applied Biosystems 7000 Applied Biosystems 7300 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems 7900 Applied Biosystems 7900 HT Fast Applied Biosystems 7900HT Applied Biosystems StepOnePlus™ Applied Biosystems StepOne™	Kompatible Geräte: Bio-Rad CFX384™ Bio-Rad CFX96™ Bio-Rad MiniOpticon™ BioRad MyiQ™ Bio-Rad/MJ Chromo4™ Bio-Rad/MJ Opticon 2 Bio-Rad/MJ Opticon® Cepheid SmartCycler® Eppendorf Mastercycler® ep realplex Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s Illumina Eco qPCR Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000 Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q Roche LightCycler™ 480
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ (KCQS00)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (KCQS01)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX (KCQS02)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ (KCQS03)	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ für Hochdurchsatz-qPCR (S9194)	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ für quantitative PCR, Kapillarformulierung (S1816)

SYBR Green PCR-Mix-Auswahlhilfe – Teil 2

ReadyMixes mit Hot Start und separaten Komponenten
Separater Referenzfarbstoff		Separates MgCl2 Separater Referenzfarbstoff
Kompatible Geräte: Siehe Anhang 1, um die optimale Referenzfarbstoff-Konzentration für Ihr Gerät zu ermitteln
SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (S4438)	LuminoCt®SYBR®Green qPCR ReadyMix™ (L6544)	SYBR® Green JumpStart™ Taq ReadyMix™ (S5193)

Protokoll

Vorbereitung

1. Alle Reaktionskomponenten auf Eis legen.
2. Mischen und dann kurz zentrifugieren, um den Inhalt am Boden des Röhrchens aufzufangen.

Standard SYBR Green I Farbstoff-Reaktion

Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Assays, die in KiCqStart-ReadyMix durchgeführt werden, optimal sind, wenn eine höhere Primerkonzentration als bei der herkömmlichen PCR verwendet wird. In den nachstehenden Protokollen wird eine Endkonzentration von 450 nM eingesetzt, die sich bei mehreren unabhängigen Assays als optimale Konzentration erwiesen hat.

1. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Mastermix vor, um alle Proben zweifach durchzuführen.
    a. Achten Sie darauf, doppelte Negativkontrollen (NTC) mitzuführen.
    b. Wählen Sie je nach ausgewähltem qPCR-Reagenz die entsprechende nachstehende Tabelle aus.
    c. Berechnen Sie die Menge der zu mischenden Reagenzien. Fügen Sie 10 % des Volumens hinzu, um Pipettierfehler auszugleichen.
d. Gut mischen und Blasen vermeiden.

Mastermix für KiCqStart-Reagenzien:

Reaktionen	Ziel-Endkonzentration	Volumen pro einzelner 20 μl Reaktion (µl)
2 X qPCR-Mix	1 X	10 μl
Vorwärtsprimer (10 µM Stamm)	0,45 µM	0,9 μl
Rückwärtsprimer (10 µM Stamm)	0,45 µM	0,9 μl
Wasser in PCR-Qualität	-	3,2 μl

Mastermix für andere vollständige qPCR-ReadyMixes:

Reaktionen	Ziel-Endkonzentration	Volumen pro einzelner 20 μl Reaktion (µl)
2 X qPCR-Mix	1 X	10 μl
Vorwärtsprimer (10 µM Stamm)	0,2 µM	0,4 μl
Rückwärtsprimer (10 µM Stamm)	0,2 µM	0,4 μl
Wasser in PCR-Qualität	-	4,2 μl

Mastermix für qPCR-Reagenzien mit separaten Komponenten:

Reaktionen	Ziel-Endkonzentration	Volumen pro einzelner 20 μl Reaktion (µl)
2 X qPCR-Mix	1 X	10 μl
Vorwärtsprimer (10 µM Stamm)	0,2 µM	0,4 μl
Rückwärtsprimer (10 µM Stamm)	0,2 µM	0,4 μl
25 mM MgCl2 (falls separat)	3,5 mM	3,5 μl1
Referenzfarbstoff (falls separat)		0 bis 0.25 μl2
Wasser in PCR-Qualität		4,2 μl

¹Die optimale MgCl₂-Konzentration kann zwischen 1 mM und 6 mM liegen.
²Informationen zur Bestimmung der optimalen Referenzfarbstoffkonzentration für Ihr Gerät finden Sie in Anhang 1.

2. Vorbereiten von Reaktionen:
    a. Für NTC-Reaktionen werden 4 μl Wasser in das Reaktionsgefäß gegeben.
    b. Für experimentelle Reaktionen werden 4 μl cDNA-Lösung in das Reaktionsgefäß gegeben.
    c. Alle Röhrchen kurz zentrifugieren. Vergewissern Sie sich visuell, dass alle Röhrchen oder Wells am Boden die Probe in der richtigen Menge enthalten.
    d. Aliquotieren Sie vorsichtig 16 μl des Template-Mastermix in jedes qPCR-Röhrchen oder Platten-Well.
    e. Die Reaktionen gut mischen und bei Bedarf schleudern.
    f. Verschließen Sie die Gefäße oder versiegeln Sie die PCR-Platte und beschriften Sie diese (entsprechend den Anforderungen des Geräts). (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt)

3. Führen Sie die Proben gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers durch. Nachfolgend finden Sie Beispiele für Standard- und Schnellzyklen.

Standard-Zyklusparameter:

	Temp	Zeit
Initiale Denaturierung	94 °C	2 min
40 Zyklen:
Denaturierung	94 °C	15 s
Hybridisieren, Erweitern und Ablesen der Fluoreszenz	60 °C oder 5 °C unter dem niedrigsten Primer-TM	1 min
(optional) Halten	4 °C nur, wenn die Produkte auf einem Gel ausgebracht werden

Schnellzyklus-Parameter:

	Temp (ºC)	Zeit (s)
Initiale Denaturierung	95	30
40 Zyklen:
Schritt 1	95	5
Schritt 2	58	15
Schritt 3	72	10

Hinweis: Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung).

4. Eine Anleitung zur Analyse der Daten finden Sie im Gerätehandbuch.

Anhang 1

Für die Verwendung mit Geräten empfohlene Referenzfarbstoff-Konzentrationen. Für qPCR-Reagenzien mit einem separaten Referenzfarbstoff

Gerät	Endgültige Referenzfarbstoff-Konzentration	µl des Referenzfarbstoffs (pro 20 µl-Reaktion)
Applied Biosystems 5700	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems 7000	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems 7300	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems 7500	0,1 X	0,02 µl
Applied Biosystems 7500 Fast	0,1 X	0,02 µl
Applied Biosystems 7700	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems 7900	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems 7900 HT Fast	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems 7900HT	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems StepOnePlus™	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems StepOne™	1 X	0,2 µl
Applied Biosystems ViiA 7	0,1 X	0,2 µl
Bibby Scientific Techne® Prime Pro 48	nicht verwendet	-
Bibby Scientific PCRmax® Eco 48	nicht verwendet	-
Bio-Rad CFX384™	nicht verwendet	-
Bio-Rad CFX96™	nicht verwendet	-
Bio-Rad MiniOpticon™	nicht verwendet	-
Bio-Rad/MJ Chromo4™	nicht verwendet	-
Bio-Rad/MJ Opticon 2	nicht verwendet	-
Bio-Rad/MJ Opticon®	nicht verwendet	-
Cepheid SmartCycler®	nicht verwendet	-
Eppendorf Mastercycler® ep realplex	nicht verwendet	-
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s	nicht verwendet	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000	nicht verwendet	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000	nicht verwendet	-
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q	nicht verwendet	-
Roche LightCycler™ 480	nicht verwendet	-
Stratagene Mx3000P®	0,1 X	0,02 µl
Stratagene Mx3005P™	0,1 X	0,02 µl
Stratagene Mx4000™	0,1 X	0,02 µl

Anleitung für die Fehlerbehebung

Problem	Mögliche Ursache	Lösung
Es wird kein PCR-Produkt beobachtet.	Eine PCR-Komponente fehlt oder ist abgebaut.	Es soll immer eine Positivkontrolle durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Komponenten funktionieren. Bei der Zusammenstellung der Reaktionen wird darüber hinaus eine Checkliste empfohlen.
	SYBR wird abgebaut.	Lassen Sie ein Agarosegel durchlaufen, um das Reaktionsprodukt zu analysieren. Wenn eine einzelne Bande in der entsprechenden Größe zu sehen ist, ist der Nachweis fehlerhaft. SYBR Green I ist lichtempfindlich und muss geschützt werden.
	Die Hybridisierungstemperatur ist zu hoch.	Verringern Sie die Hybridisierungstemperatur in Schritten von 2-4 °C.
	Das Template ist von schlechter Qualität.	Prüfen Sie die Integrität des Templates durch Agarose-Gelelektrophorese. Es kann notwendig sein, das Template mit Methoden aufzureinigen, die Scheren und Nicking-Aktivitäten minimieren. Es kann sein, dass aufgrund eines Fehlers bei Extraktion oder Aufreinigung kein Template vorhanden ist.
	Die Primer sind nicht optimal konzipiert.	Prüfen Sie den Primer-Satz, indem Sie eine Verdünnungsreihe mit einem bekannten Template durchführen. Bei Bedarf nachbestellen oder neu konzipieren.
	Die anfängliche Denaturierungstemperatur hält zu lange an.	Aktivierungsschritt entfernen. JumpStart-Taq kann bei langen (> 3 min) anfänglichen Denaturierungszeiten abgebaut werden.
	Das Zieltemplate ist komplex.	In den meisten Fällen sind inhärent komplexe Targets auf eine(n) ungewöhnlich hohe(n) GC-Gehalt und/oder Sekundärstruktur zurückzuführen. Es ist bekannt, dass Betain die Amplifikation von Templates mit hohem GC-Gehalt in einer Konzentration von 0,8-1,3 M unterstützt.2
	Referenzfarbstoff ist unpassend	Im Fall von Rn (normalisierte Fluoreszenz) wird in Plots der Referenzfarbstoff abgeschaltet. Alternativ kann auch die Rohfluoreszenz des qPCR-Amplifikationsplots angezeigt werden. Durch das Entfernen der Normalisierung erhalten die Plots häufig wieder die erwartete Form und ermöglichen die Berechnung nachvollziehbarer Ct-Werte. Alternativ kann auch der Referenzfarbstoff in der Reaktion titriert werden. Siehe Vorschläge im letzten Abschnitt zur Fehlerbehebung.
	Es werden zu wenige Zyklen durchgeführt.	Erhöhen Sie die Anzahl der Zyklen.
	Es steht nicht ausreichend Template zur Verfügung.	Wenn die Erhöhung der Zyklenzahl keinen Erfolg zeigt, wiederholen Sie die Reaktion mit einer 10-fach höheren Konzentration des Templates.
	Das PCR-Produkt ist zu lang.	Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die PCR-Produkte zwischen 100-150 bp liegen und 800 bp nicht überschreiten.
	Die Mg2+ Konzentration ist suboptimal.	Die optimale Magnesiumchloridkonzentration kann je nach Assay variieren und zwischen 1,5 und 5 mM liegen. Verwenden Sie 25 mM MgCl2 (M8787), um eine Magnesiumchlorid-Titration in diesem Bereich durchzuführen.
	Der Nachweis wurde nicht oder im falschen Schritt aktiviert.	Vergewissern Sie sich, dass der Erfassungsmodus für einen korrekten Nachweis eingeschaltet ist. Der Erfassungsmodus für den SYBR-Green-Nachweis ist "single" und wird im Verlängerungsschritt oder im optionalen Nachweisschritt erfasst.
	Die Primer werden abgebaut.	Prüfen Sie den Primerabbau auf einem Polyacrylamidgel.
	Falsche Farbstoffschicht gewählt.	Stellen Sie sicher, dass der verwendete Reporter in der Setup-Ansicht der Sequenznachweis-Software aktiviert ist.
	Falsche Werte auf der y-Achse	Ändern Sie die Werte auf der y-Achse. Durch einen Doppelklick auf ΔRn können die Werte der y-Achse verändert werden.
Der Wirkungsgrad der PCR ist zu niedrig (< 80 %)	Die Hybridisierungstemperatur ist zu niedrig.	Erhöhen Sie die Hybridisierungstemperatur in Schritten von 2-3 °C.
	Template enthält Inhibitoren	Erstellen Sie eine Standardkurve (log [DNA] gegen Cq). Wenn die Kurve bei hohen DNA-/cDNA-Konzentrationen nicht linear ist, überarbeiten Sie entweder die DNA-/cDNA-Aufreinigung oder begrenzen Sie die Template-Konzentrationen auf den linearen Bereich.
	Die Primer sind nicht optimal konzipiert.	Lassen Sie eine Schmelzkurve oder ein Agarosegel durchlaufen, um zu prüfen, ob mehrere Amplikons vorhanden sind.
	Das Template ist von schlechter Qualität.	Prüfen Sie die Integrität des Templates durch Agarose-Gelelektrophorese. Es kann notwendig sein, das Template mit Methoden aufzureinigen, die Scheren und Nicking-Aktivitäten minimieren.
	Die anfängliche Denaturierungstemperatur hält zu lange an.	Aktivierungsschritt entfernen. Antikörper Hot-Start Taq kann bei langen (> 3 min) anfänglichen Denaturierungszeiten abgebaut werden.
	Mehrere Stellen hybridisieren mit dem Primersatz.	Lassen Sie eine Schmelzkurve oder ein Agarosegel durchlaufen, um zu prüfen, ob mehrere Amplikons vorhanden sind. Alternativ kann für ein sequenziertes Zielgenom das NCBI-Programm e-PCR verwendet werden, um nach multiplen Amplikons zu suchen.
	Pipettierfehler verursachen die Schwankung	Bereiten Sie eine große Menge der vollständigen Mischung vor und aliquotieren Sie diese in separate Reaktionen. Wenn die Varianz weiterhin besteht, siehe unten.
	Falscher Referenzfarbstoff oder falsche Konzentration für das Gerät verwendet	Die für die Verwendung mit den Geräten empfohlenen Farbstoffkonzentrationen sind in Anlage 1 enthalten.
	Referenzfarbstoff ist unpassend	Im Fall von Rn (normalisierte Fluoreszenz) wird in Plots der Referenzfarbstoff abgeschaltet. Alternativ kann auch die Rohfluoreszenz des qPCR-Amplifikationsplots angezeigt werden. Durch das Entfernen der Normalisierung erhalten die Plots häufig wieder die erwartete Form und ermöglichen die Berechnung nachvollziehbarer Ct-Werte. Wenn eine Normalisierung gewünscht wird, muss die optimale Menge des Referenzfarbstoffs durch Titration bestimmt werden.
Das Signal ist unabhängig von der Verdünnung des Templates (Mehrfachprodukte oder ausgestrichene Produkte)	Die Hybridisierungstemperatur ist zu niedrig.	Erhöhen Sie die Hybridisierungstemperatur in Schritten von 2-3 °C.
	Die Primer sind nicht optimal konzipiert.	Überprüfen Sie die Genauigkeit der Sequenzinformationen. Wenn die Primer weniger als 27 Nukleotide lang sind, versuchen Sie, die Primer auf 27-33 Nukleotide zu verlängern. Wenn der Primer einen GC-Gehalt von weniger als 45 % aufweist, versuchen Sie, die Primer mit einem GC-Gehalt von 45-60 % neu zu entwickeln.
	Die Template-Konzentration ist zu hoch.	Reduzieren Sie die Konzentration des Templates in der PCR-Reaktion.
	Die Primer-Konzentration ist zu hoch.	Reduzieren Sie die Primer-Konzentrationen in einer Reihe von zweifachen Verdünnungen (d. h. 0,1 µM, 0,05 µM, 0,025 µM und 0,0125 µM) und führen Sie mit diesen Testreaktionen eine PCR durch.
Der Wirkungsgrad der PCR ist zu hoch.	Mehrere Stellen hybridisieren mit dem Primersatz.	Lassen Sie eine Schmelzkurve oder ein Agarosegel durchlaufen, um zu prüfen, ob mehrere Amplikons vorhanden sind. Alternativ kann für ein sequenziertes Zielgenom das NCBI-Programm e-PCR verwendet werden, um nach multiplen Amplikons zu suchen.
Technische Replikate liefern stark schwankende Ct-Werte oder die Daten ergeben nicht auswertbare Amplifikationskurven	Pipettierfehler verursachen die Schwankung	Bereiten Sie eine große Menge der vollständigen Mischung vor und aliquotieren Sie diese in separate Reaktionen. Wenn die Varianz weiterhin besteht, siehe unten.
	Falscher Referenzfarbstoff oder falsche Konzentration für das Gerät verwendet	Die für die Verwendung mit den Geräten empfohlenen Farbstoffkonzentrationen sind in Anlage 1 enthalten.
Große Variabilität innerhalb der Proben und/oder Duplikate.	Die Reaktionen sind nicht gut gemischt.	Die Reaktionen leicht vortexen und zentrifugieren.
	Nicht dicht verschlossene oder abgedeckte Wells.	Verschließen oder decken Sie alle Wells dicht ab, auch die leeren. Lose Kappen können die Abdichtung benachbarter Wells beeinträchtigen.
	Die anfängliche Denaturierung dauert zu lange.	Verringern Sie den Zeitraum für die anfängliche Denaturierung auf nicht mehr als zwei Minuten.
Mehrere PCR-Produkte	Die Primer sind nicht optimal konzipiert.	Bestätigen Sie die Richtigkeit der Sequenzinformationen und die Spezifität der Primer-Sequenz für die Nicht-Zielsequenz. Erhöhen Sie die Länge der Primer, um sie zielspezifischer zu machen.
	Die Primer werden abgebaut.	Prüfen Sie den Primerabbau auf einem Polyacrylamidgel.
	Die Mg2+ Konzentration ist suboptimal.	Die optimale Magnesiumchloridkonzentration kann je nach Assay variieren und zwischen 1,5 und 5 mM liegen. Verwenden Sie 25 mM MgCl2 (M8787), um eine Magnesiumchlorid-Titration in diesem Bereich durchzuführen.
	Die Hybridisierungstemperatur ist zu niedrig.	Erhöhen Sie die Hybridisierungstemperatur in Schritten von 2-3 °C.
	Kontaminierende DNA	Überprüfen Sie alle Reagenzien auf mögliche Verunreinigungen und richten Sie die Reaktionen in einer Laminar-Flow-Werkbank ein, um Verunreinigungen durch andere Reaktionen zu vermeiden.
	Primer-Dimere wurden amplifiziert	Nehmen Sie den optionalen Nachweisschritt in das Zyklusprogramm auf, um den Nachweis von Primer-Dimeren zu vermeiden.
	Die Template-Konzentration ist zu hoch.	Reduzieren Sie die Konzentration des Templates in der PCR-Reaktion.
	Die Primer-Konzentration ist zu hoch.	Reduzieren Sie die Primer-Konzentrationen in einer Reihe von zweifachen Verdünnungen (d. h. 0,1 µM, 0,05 µM, 0,025 µM und 0,0125 µM) und führen Sie mit diesen Testreaktionen eine PCR durch.
Die Linearität der Kreuzungspunktwerte entspricht nicht dem Log der Template-Menge	Die Template-Menge ist zu groß.	Überschreiten Sie nicht die empfohlenen Höchstmengen an Template-DNA.
	Die Template-Menge ist zu niedrig.	Erhöhen Sie die DNA-Menge.
	Kontaminierende DNA	Überprüfen Sie alle Reagenzien auf Verunreinigungen und führen Sie die Reaktionen in einer Laminar-Flow-Werkbank durch, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
	Primer-Dimere wurden amplifiziert	Nehmen Sie den optionalen Nachweisschritt in das Zyklusprogramm auf, um den Nachweis von Primer-Dimeren zu vermeiden.
Fluoreszenz wird nicht nachgewiesen oder ist variabel	SYBR Green ReadyMix war nicht gut gemischt.	Mischen Sie ReadyMix vor der Verwendung gründlich, um sicherzustellen, dass das SYBR Green in der richtigen Konzentration zu allen Kapillaren hinzugefügt wird.
	Das Gerät für die quantitative PCR ist kontaminiert.	Dekontaminieren Sie das Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
	Die Amplifikationskurven erreichen ein Maximum und nehmen dann bei hohen Template-Mengen ab	Verringern Sie die Anzahl der für die Berechnung der Grundlinie verwendeten Zyklen. Die Grundlinienkorrektur überkompensiert und negiert das Signal.
	Ungeeignete Expositionszeit	Ändern Sie die Expositionszeit entsprechend, wenn Sie Kappen (25) oder optische Klebeabdeckungen (10) verwenden.

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