MystiCq^® MicroRNA^® Quantifikationssystem

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Arbeitsablauf

Abbildung 1. microRNA-Arbeitsablauf

Hintergrund

MicroRNA sind kleine (22–24 Nukleotide), nicht kodierende RNA-Moleküle, die wichtige Regulatoren der Genexpression in verschiedenen eukaryotischen Organismen sind. Sie weisen einzigartige Expressionsmuster auf und ihre Expressionswerte können zwischen verschiedenem Gewebe stark variieren. Eine einzelne microRNA kann die Expression mehrerer Zielgene hemmen, indem sie an mRNA bindet und entweder die Translation hemmt oder die Zersetzung steigert. Es werden fortlaufend neue microRNA entdeckt und umfassenden Untersuchungen unterzogen, was zur Entwicklung neuartiger Diagnosereagenzien und Ziele für therapeutische Maßnahmen bei menschlichen Erkrankungen führt.

Wie bei jedem RT-qPCR-Verfahren beginnt alles mit der Probenisolation. Da microRNA klein sind, können gängige RNA-Aufreinigungskits mit Fokus auf die Gesamt-RNA kleine RNA im Endprodukt nicht erhalten. Wir haben drei verschiedene Produkte für die Isolation von microRNA aus verschiedenen biologischen Quellen:

• RNAzol^® RT (R4533)
• mirPremier microRNA-Isolationskit (SNC10 oder SNC50)
• GenElute™-Aufreinigungskit RNA/DNA/Protein Plus (E5163)

Jedes Produkt bietet eine eigene Reihe von Merkmalen und Vorteilen, basierend auf Zeit, Probenart und Arten von zu isolierender RNA. In dieser Anwendung wird RNAzol^® RT verwendet.

Nachdem die microRNA isoliert wurde, muss sie, wie jede RNA, vor dem Amplifikationsschritt zuerst in eine cDNA-Matrize revers transkribiert (RT) werden. Die MystiCq^® microRNA^®-Produktlinie stellt alle Reagenzien bereit, die für die Umwandlung und Quantifizierung von microRNA erforderlich sind.

Aufgrund ihrer kleinen Größe ist es schwierig, traditionelle Verfahren für RT zu verwenden. microRNA fehlt außerdem ein Poly-A-Ende, wodurch die Verwendung von Oligo-dT-Primern nicht möglich ist, und beliebige Primer binden vielleicht nicht optimal. Unabhängig von diesen Einschränkungen entwickelten Wissenschaftler Wege, um Matrizen, die sich für PCR eignen, aus microRNA zu erzeugen. Der Erste ist eine Polyadenylierung der microRNA, gefolgt von einer Oligo-dT-Primer-RT. In der Regel wird eine modifizierte Primersequenz an dem Oligo-dT verankert, um eine größere Matrize für die PCR-Reaktion zu erzeugen.

Die MystiCq^® microRNA^® cDNA-Synthesemischung (MIRRT) enthält alles, was für die Umwandlung von microRNA in für qPCR geeignete cDNA-Matrizen erforderlich ist. Sie bietet einen breiten, linearen Messbereich für Eingangs-RNA und umfasst separate Polyadenylierungs- und RT-Schritte, sodass die geeigneten Kontrollen für die Hintergrundmessung verwendet werden können. Der „universelle“ Prozess ermöglicht außerdem die Umwandlung aller microRNA, sodass eine künftige qPCR-Analyse von noch nicht entdeckten microRNA möglich ist.

Abbildung 2. microRNA-Abbildungen

Protokolle

microRNA-Isolation mit RNAzol^® RT

Assay-Erwägungen

RNAzol^® RT ist ein schnelles und praktisches Reagens zur Verwendung bei der einstufigen Isolation von Gesamt- und kleiner RNA aus biologischen Proben menschlichen, tierischen, pflanzlichen, Hefe-, bakteriellen und viralen Ursprungs. Eine praktische einstufige Flüssigphasenabscheidung führt zur Isolation von RNA aus DNA, Protein, Polysacchariden und anderen Molekülen. RNAzol^® RT kann zur Isolation getrennter Fraktionen von mRNA und microRNA oder zur Isolation von Gesamt-RNA, die alle Klassen von RNA in einer einzelnen Fraktion enthält, eingesetzt werden.

Dieses Produkt ist eine Mischung aus Guanidinthiocyanat und Phenol in einer einphasigen Lösung, die DNA, RNA und Protein bei der Homogenisierung oder Lyse von Gewebeproben wirksam löst. Die Zugabe von Wasser zu der Mischung ermöglicht die Ausfällung von DNA, Proteinen, Polysacchariden und anderen Molekülen, die durch Zentrifugieren entfernt werden können. Die RNA kann anschließend durch Alkoholpräzipitation, Waschen und Solubilisieren aus dem Überstand isoliert werden. Eine chloroforminduzierte Phasentrennung ist nicht erforderlich. Ein ml RNAzol^® RT reicht aus, um RNA aus bis zu 100 mg Gewebe, 1 × 10⁷ Zellen oder 10 cm² Kulturschalenoberfläche bei Zellen zu isolieren, die in einer Monoschicht wachsen..

Dies ist eine der wirksamsten Methoden für die Isolation von Gesamt- und kleiner RNA, und kann, ausgehend von frischem Gewebe oder Zellen, bei Raumtemperatur in weniger als 1 Stunde abgeschlossen sein. Das Protokoll zur Isolation von mRNA und microRNA erzeugt zwei Fraktionen: eine mRNA-haltige Fraktion aus RNA mit > 200 Basen und eine microRNA-haltige Fraktion aus RNA mit < 200 Basen. Die Isolation von Gesamt-RNA ist sehr wirksam für die Isolation von RNA-Molekülen aller Arten: große nukleäre RNA, rRNA, mRNA, kleine RNA und microRNA. Die resultierende RNA ist intakt und nur schwach oder gar nicht mit DNA und Protein kontaminiert. Sie kann für Northern Blot, RNase-Schutz-Assay, Microarrays, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und andere molekularbiologische Anwendungen eingesetzt werden.

Reagenzien

• RNAzol^®RT (R4533)
• 75 % Ethanol
  • 200 Proof, absolut), für die Molekularbiologie (E7023)
  • Wasser für die Molekularbiologie (W4502)
• 100 % Isopropanol (I9516)

Verfahren

A. Probenvorbereitung – Auswahl des geeigneten Probentyps:

1. Gewebe: Homogenisieren Sie Gewebeproben in RNAzol^® RT (1 ml je bis zu 100 mg Gewebe) mit einem Polytron^® oder einem anderen geeigneten Homogenisierungsapparat.
   Hinweis: Wenn das Gewebe einen hohen DNA-Gehalt aufweist (z. B. Milzgewebe), verwenden Sie 1 ml Reagens je 50 mg Gewebe.
2. Monoschichtzellen: Lysen Sie die Zellen direkt in der Kulturschale. Verwenden Sie nach dem Entfernen des Kulturmediums mindestens 1 ml RNAzol^® RT je 10 cm² Oberfläche der Glaskulturplatte. Nach der Zugabe des Reagens sollte das Zelllysat mehrmals pipettiert werden, um ein homogenes Lysat zu bilden.
3. Suspensionszellen: Isolieren Sie die Zellen mittels Zentrifugieren und lysen Sie sie anschließend durch wiederholtes Pipettieren in TRI-Reagens. 1 ml des Reagens reicht aus, um 5–10 × 10⁶Tier-, Pflanzen- oder Hefezellen oder 10⁷Bakterienzellen zu lysen. Hinweise:
   i. Einige Hefe- oder Bakterienzellen können einen Homogenisierungsapparat erfordern.
   ii. Nachdem die Zellen in TRI-Reagens homogenisiert oder lysiert wurden, können die Proben bei -70 °C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.
4. Flüssige Proben: Lysen Sie mit 1 ml RNAzol^® RT je 0,4 ml Probe. Ergänzen Sie Proben mit geringem Volumen mit RNase-freiem Wasser, um ein Probenvolumen von 0,4 ml zu erhalten, bevor Sie 1 ml RNAzol® RT zugeben.
   

B. microRNA-Isolation

1. Geben Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie ein zweites Mal. Geben Sie die wässrige Phase in ein sauberes Röhrchen
2. Geben Sie 0,4 ml RNase-freies Wasser je ml RNAzol^® RT zu, das für die Homogenisierung verwendet wird. Decken Sie die Probe dicht ab, schütteln Sie sie 15 Sekunden lang und lassen Sie sie 5–15 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
3. Zentrifugieren Sie die resultierende Mischung bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4–28 °C. Das Zentrifugieren trennt die Mischung in einen halbfesten Rückstand (der DNA, Proteine und Polysaccharide enthält) und einen oberen Überstand (der RNA enthält). Geben Sie den Überstand in ein neues Röhrchen. Lassen Sie dabei eine Schicht des Überstands über dem DNA-/Proteinrückstand.
   Hinweise:
   i. Proben, die mit 1 ml RNAzol^® RT je 100 mg Gewebe homogenisiert wurden, erfordern eine Standzeit von 15 Minuten.
   ii. Bis zu 85 % des Überstands können für die Isolation von RNA gesammelt werden.
4. Geben Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und geben Sie 0,4 ml 75 % Ethanol (v/v) zu, um mRNA auszufällen.
5. Lassen Sie die Probe 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
6. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 8 Minuten bei 4 . Die mRNA-Ausfällung bildet einen weißen Rückstand an der Seite und am Boden des Röhrchens.
7. Geben Sie den Überstand sofort in ein sauberes Röhrchen, ohne den Rückstand dabei zu stören.
8. Hinweise:
   i. Dieser Überstand enthält mRNA und andere RNA mit > 200 Basen, einschließlich große nukleäre RNA und ribosomale RNA.
   ii. Der microRNA-haltige Überstand kann bei -20 °C ein Jahr aufbewahrt werden.
9. Geben Sie 0,8 Volumen 100 % Isopropanol zu dem Überstand.
10. Lassen Sie die Probe 30 Minuten bei 4 °C stehen.
11. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 15 Minuten bei 4–28 °C. Die microRNA-Ausfällung bildet einen weißen Rückstand am Boden des Röhrchens.
    Hinweis: Diese Fraktion enthält microRNA und andere RNA mit < 200 Basen, einschließlich kleine ribosomale RNA und tRNA.
12. Waschen Sie den microRNA-Rückstand zweimal mit 0,4–0,6 ml 75 % Ethanol (v/v) bzw. 70 % Isopropanol (v/v) je 1 ml Überstand, der für die Ausfällung verwendet wird. Zentrifugieren Sie bei 4.000–8.000 × g für 1–3 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Alkohollösung mit einer Mikropipette.
13. Lösen Sie die RNA-Rückstände ohne Trocknen in RNase-freiem Wasser zu einer Konzentration von 0,1 µg/µl. Vortexen Sie die Proben bei Raumtemperatur für 2–5 Minuten.
14. Hinweise:
    i. Ein Trocknen des RNA-Rückstands kann die Löslichkeit verringern und wird nicht empfohlen.
    ii. Die endgültige Aufbereitung von microRNA ist frei von DNA und Proteinen. Sie sollte ein Verhältnis von A₂₆₀/A₂₈₀ von 1,6–1,7 und ein Verhältnis von A₂₆₀/A₂₃₀ von etwa 1,5 aufweisen.

Anleitung zur Fehlerbehebung bei der RNA-Isolation

Geringe RNA-Ausbeute	unvollständige Homogenisierung oder Lyse der Proben
	der endgültige RNA-Rückstand könnte nicht vollständig gelöst sein
Das Verhältnis von A260/A280 beträgt < 1,65	die für die Homogenisierung verwendete Probenmenge könnte zu gering sein
	die Proben könnten nach der Homogenisierung nicht für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen worden sein
	eine Kontaminierung der wässrigen Phase mit der Phenolphase könnte aufgetreten sein
	der endgültige RNA-Rückstand könnte nicht vollständig gelöst sein
RNA-Zersetzung	die Gewebe könnten nach dem Entfernen aus dem Tier nicht umgehend verarbeitet oder eingefroren worden sein
	die für die Isolation verwendeten Proben oder die isolierten RNA-Aufbereitungen könnten bei -20 °C statt wie in dem Verfahren spezifiziert bei -70 °C gelagert worden sein
	die Zellen könnten durch den Trypsinaufschluss dispergiert worden sein
	für das Verfahren verwendete wässrige Lösungen oder Röhrchen könnten nicht RNase-frei sein
	das für die Agarose-Gelelektrophorese verwendete Formaldehyd könnte einen pH-Wert von < 3,5 aufweisen
DNA-Kontaminierung	das für die Probenhomogenisierung verwendete Reagensvolumen könnte zu gering gewesen sein
	die für die Isolation verwendeten Proben könnten organische Lösungsmittel (Ethanol, DMSO), starke Puffer oder alkalische Lösungen enthalten

microRNA cDNA-Synthese mit MystiCq^® microRNA cDNA-Synthesemischung

Assay-Erwägungen

Die MystiCq^® microRNA cDNA-Synthesemischung wurde für eine leichte Umwandlung von microRNA zu cDNA-Matrizen für die qPCR konzipiert, ausgehend von für microRNA vorangereicherten Gesamt-RNA- oder RNA-Aufbereitungen. Neue Studien zeigten jedoch, dass Gesamt-RNA-Aufbereitungen und eine Voranreicherung für microRNA nicht mehr erforderlich sind.

MicroRNA sind nicht von Natur aus polyadenyliert. Mit dem MystiCq^® microRNA cDNA-Synthesekit werden microRNA durch eine Poly(A)polymerasereaktion polyadenyliert. Anschließend werden ReadyScript™ reverse Transkriptase und andere erforderliche Reagenzien für die cDNA-Synthese nacheinander zugegeben, um die microRNA mit Poly(A)-Ende durch einen Oligo-dT-Adapter-Primer in cDNA umzuwandeln. Der Adapter-Primer weist an seinem 5'-Ende eine einzigartige Sequenz auf, die eine Amplifikation von cDNA in Echtzeit-RT-qPCR-Reaktionen ermöglicht.

Das Kit umfasst einen humanen positiven Kontroll-Primer, der zum Quantifizieren eines Zielgens, das in den meisten menschlichen Geweben universell exprimiert wird, verwendet werden kann: die kleine nukleoläre RNA SNORD44. Es gibt ausreichend Poly(A)-Ende-bildenden Puffer und microRNA cDNA-Reaktionsmischung, um keine Poly(A)-Polymerase und keine Kontrollreaktionen mit reverser Transkriptase zu benötigen.

Reagenzien

• Das MystiCq^® microRNA cDNA-Synthesemischungskit (MIRRT) enthält die folgenden Komponenten:
  • Poly(A)-Ende-bildender Puffer (5 X), MIRRT01
  • Humaner positiver Kontroll-Primer, MIRRT02
  • Nukleasefreies Wasser, MIRRT03
  • MysticCq™ Universal-PCR-Primer, MIRRT04 oder MIRUP
  • Poly(A)-Polymerase, MIRRT05
  • MystiCq™ microRNA cDNA-Reaktionsmischung, MIRRT06
  • ReadyScript reverse Transkriptase, MIRRT07
• Röhrchen; wählen Sie eines der Folgenden, das dem gewünschten Format entspricht:
  • Einzelne dünnwandige 200-µl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
  • Einzelne dünnwandige 650-µl-PCR-Röhrchen (Z374873)

Verfahren

Poly(A)-Ende-bildende Reaktion

1. Legen Sie die Komponenten nach dem Auftauen (außer Enzym) auf Eis. Mischen und zentrifugieren Sie anschließend kurz, um den Inhalt vom Boden des Röhrchens zu gewinnen.
2. Kombinieren Sie die folgenden Reagenzien in 0,2-ml-Mikroröhrchen oder einer 96-Well-Mikrotiterplatte auf Eis.

Reagens	Volumen
Poly(A)-Ende-bildender Puffer (5 X)	2 μl
RNA (bis zu 1 µg Gesamt-RNA oder mit microRNA angereicherte RNA)	Bis zu 7 µl
Nukleasefreies Wasser	Variabel
Poly(A)-Polymerase	1 μl
Gesamtvolumen	10 μl

3. Nachdem Sie jede Reaktion verschlossen haben, vortexen Sie sie sanft, um den Inhalt zu mischen. Zentrifugieren Sie kurz, um die Komponenten am Boden des Röhrchens zu gewinnen.

4. Inkubieren:

• 60 Minuten bei 37 °C
• 5 Minuten bei 70 °C

5. Zentrifugieren Sie kurz, um den Inhalt zu sammeln. Vor der cDNA-Synthese auf Eis halten. Wenn Sie 100 ng oder weniger Gesamt-RNA verwenden, kann die Inkubation bei 37 °C auf 20 Minuten verkürzt werden.

Erststrang-cDNA-Synthesereaktion

Vorbereitung der cDNA-Synthesereaktion:

Reagens	Volumen
Poly(A)-Ende-bildende Reaktion (aus dem vorstehenden letzten Schritt)	10 μl
MystiCq® microRNA cDNA-Reaktionsmischung	9,0 μl
ReadyScript reverse Transkriptase	1,0 μl
Gesamtvolumen	20 μl

6. Nachdem Sie jede Reaktion verschlossen haben, vortexen Sie sie sanft, um den Inhalt zu mischen. Zentrifugieren Sie kurz, um die Komponenten zu sammeln

7. Inkubieren:* Die RT-Reaktion kann bei 45 °C erfolgen, um den Hintergrund zu verringern ohne die Sensitivität zu beeinträchtigen.

• 20 Minuten bei 42 °C
• 5 Minuten bei 8,5 °C

8. Falls erforderlich, kann das microRNA cDNA-Produkt mit Wasser oder 10 mmol/l Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 0,1 mmol/l EDTA (für die Langzeitlagerung empfohlen) verdünnt werden. Verdünnte cDNA ist bei 4 °C mehrere Monate stabil. Die cDNA kann bei -20 °C langzeitig gelagert werden.

Echtzeit-SYBR Green-RT-qPCR-Amplifikation von microRNA.

Assay-Erwägungen

Individuelle microRNA werden mit spezifischem MystiCq^®microRNA-qPCR-Assay-Primer und dem MystiCq^® Universal-PCR-Primer (der spezifisch an die einzigartige Sequenz bindet, die während der RT-Reaktion durch den Oligo-dT-Adapter-Primer in die cDNA eingebracht wurde) in Echtzeit-SYBR ^® Green-RT-qPCR-Reaktionen quantifiziert. Die vorkonzipierten und validierten MystiCq^® microRNA-Assays bieten maximale Sensitivität und Spezifizität bei der RT-qPCR-Amplifikation und Quantifizierung von microRNA.

Echtzeit-SYBR Green-RT-qPCR wird mit je 200 nmol/l von MystiCq^® microRNA-qPCR-Assay-Primer und MystiCq^® Universal-PCR-Primer zusammen mit dem geeigneten MystiCq^® microRNA SYBR Green-qPCR-ReadyMix-Produkt durchgeführt, das von der verwendeten Instrumentenplattform abhängt. Bitte beziehen Sie sich auf die Referenztabelle für Instrumente, um die geeignete Formulierung für Ihr Instrument auszuwählen.
Eine Schlüsselkomponente des MystiCq^® microRNA-SYBR-ReadyMix ist die Hot-Start-Taq-DNA-Polymerase, die monoklonale Antikörper enthält, die an die Polymerase binden und sie vor dem anfänglichen PCR-Denaturierungsschritt inaktiv halten. Nach der Wärmeaktivierung (2 Minuten bei 95 °C) denaturieren die Antikörper irreversibel und setzen dabei eine vollständig aktive, nicht modifizierte Taq-DNA-Polymerase frei. Dies ermöglicht eine spezifische und effiziente Primerverlängerung mit dem Vorteil einer Reaktionsanordnung bei Raumtemperatur.

Primer

• Die Entwicklung von hochspezifischen Primern ist der wichtigste Parameter für eine erfolgreiche Echtzeit-PCR mit dem Farbstoff SYBR Green I.
• Vorentwickelte Primer, die den strengen Designkriterien entsprechen sind verfügbar

Produktbeschreibung	Produktnummernbereich
MystiCq® microRNA-qPCR-Assay-Primer	MIRAP00001 bis MIRAP01434
MystiCq® microRNA-qPCR-Kontrollprimer	MIRCP00001 bis MIRCP00016
MystiCq® Universal-PCR-Primer	MIRUP

• Die Verwendung von computergestützten Primerdesign-Programmen wird empfohlen, um das Potenzial für eine interne Sekundärstruktur und Ergänzung an 3'-Enden innerhalb jedes Primers und des Primer-Paars zu minimieren.

Amplicon-Größe

• MystiCq^® microRNA^® SYBR^® Green qPCR-RadyMix™ kann Fragmente von 400 bis 500 bp leicht amplifizieren. Für die besten Ergebnisse sollte die Amplicon-Größe jedoch auf 80 bis 200 bp beschränkt werden.
• Optimale Ergebnisse können eine Titration der Primer-Konzentration von 100 bis 500 nmol/l erfordern. Eine Endkonzentration von 300 nmol/l für jeden Primer ist für die meisten Reaktionen wirksam.

Assay-Vorbereitung

• Die Vorbereitung des Reaktionscocktails wird empfohlen, um Pipettierfehler zu verringern und die Genauigkeit des Assays zu maximieren.
• Stellen Sie den Reaktionscocktail aus allen erforderlichen Komponenten zusammen, mit Ausnahme der Probenmatrix (genomische DNA oder cDNA), und füllen Sie gleiche Aliquote in jedes Reaktionsröhrchen.
• Geben Sie als letzten Schritt die DNA-Matrix zu jeder Reaktion. Eine Zugabe der Proben in Volumen von 5 bis 10 µl verbessert die Genauigkeit des Assays.

Matrizenkonzentration – die empfohlenen Eingangsmengen der Matrix sind:

• cDNA – entsprechend 1 pg bis 100 ng Gesamt-RNA
• genomische DNA – 100 pg bis 100 ng genomische DNA

Reagenzien

Primer

Name	Produktnummern	Beschreibung
MystiCq® microRNA-qPCR-Assay-Primer	MIRAP00001 bis MIRAP01434	Experimentelle microRNA-Sequenzen, die für Mensch, Maus und Ratte entwickelt wurden (können mit anderen Spezies kreuzreagieren)
MystiCq® microRNA-qPCR-Kontrollprimer	MIRCP00001 bis MIRCP00016	Kontrollprimer
MystiCq® Universal-PCR-Primer	MIRUP	Komplementär zu der Adaptersequenz, die während der cDNA-Synthese hinzugefügt wird
Besuchen Sie unsere MystiCq® -Produktseite, um eine aktuelle Produktliste einzusehen

Wählen Sie das qPCR-Reagens in Abhängigkeit des verwendeten Instruments:

	MystiCq®µRNA® SYBR®qPCR ReadyMix™	MystiCq®µRNA® SYBR qPCR ReadyMix Low ROX™	MystiCq®µRNA® SYBR qPCR ReadyMix mit ROX	MystiCq® µRNA® SYBR qPCR ReadyMix iQ
	MIRRM00	MIRRM01	MIRRM02	MIRRM03
Name des Echtzeit-PCR-Instruments
Applied Biosystems 5700			•
Applied Biosystems 7000			•
Applied Biosystems 7300			•
Applied Biosystems 7500		•
Applied Biosystems 7500 Fast		•
Applied Biosystems 7700			•
Applied Biosystems 7900			•
Applied Biosystems 7900 HT Fast			•
Applied Biosystems 7900HT			•
Applied Biosystems StepOnePlus™			•
Applied Biosystems StepOne™			•
Applied Biosystems ViiA 7		•
Bio-Rad CFX384™	•
Bio-Rad CFX96™	•
BioRad iCycler iQ™				•
BioRad iQ™5				•
Bio-Rad MiniOpticon™	•
BioRad MyiQ™				•
Bio-Rad/MJ Chromo4™	•
Bio-Rad/MJ Opticon 2	•
Bio-Rad/MJ Opticon®	•
Cepheid SmartCycler®	•
Eppendorf Mastercycler® ep realplex	•
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s	•
Illumina Eco qPCR	•
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000	•
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000	•
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q	•
Roche LightCycler™ 480	•
Stratagene Mx3000P®		•
Stratagene Mx3005P™		•
Stratagene Mx4000™		•

PCR Röhrchen; wählen Sie Röhrchen, die dem gewünschten Format entsprechen:

• Einzelne dünnwandige 200-µl-PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
• Platten
  • 96-Well-Mikrotiterplatten (Z374903)
  • 384-Well-Mikrotiterplatten (Z374911)
• Plattenabdichtungen
  • ThermalSeal RTS™-Dichtungsfolien (Z734438)
  • ThermalSeal RT2RR™-Folie (Z722553)

Protokoll

• Stellen Sie ausreichend Master-Mix her, um alle Proben zweifach zu prüfen.
  • Stellen Sie sicher, doppelte Negativkontrollen ohne Matrizen einzuschließen.
  • Berechnen Sie die Menge der zu mischenden Reagenzien. Stellen Sie wegen möglicher Pipettierfehler 10 % des Volumens zusätzlich her.
• Geben Sie 25 µl Master-Mix in jedes Röhrchen.

Reaktionsmischung:

Reagens	Volumen
MystiCq® microRNA SYBR Green-qPCR-ReadyMix (2 X)	25 μl
MystiCq® microRNA qPCR-Assay-Primer (10 μmol/l) oder MystiCq®microRNA qPCR-Kontrollprimer	1,0 μl
MystiCq® Universal-PCR-Primer (10 μmol/l)	1,0 μl
microRNA cDNA (0,1–10 ng)	Variabel
Nukleasefreies Wasser	Variabel
Gesamtvolumen	50 μl

Die Menge der microRNA cDNA kann abhängig von dem Maß der Expression der microRNA angepasst werden. Verwenden Sie als Ausgangspunkt etwa 1 ng Gesamt-RNA-Äquivalent je RT-qPCR-Reaktion. Für microRNA, die in geringem Maß exprimiert werden, können Sie 10 ng Gesamt-RNA-Äquivalent je RT-qPCR-Reaktion verwenden. Für die meisten Anwendungen sind 20 bis 25 µl RT-qPCR-Reaktionsvolumen geeignet. Die Reaktionsvolumen können nach Bedarf jedoch auch vergrößert oder verkleinert werden.

• Nachdem Sie jede Reaktion verschlossen haben, vortexen Sie sie sanft, um den Inhalt zu mischen. Zentrifugieren Sie kurz, um die Komponenten am Boden des Röhrchens zu gewinnen.
• Verwenden Sie ein zwei- oder dreistufiges Cycling der Reaktionen mit den aufgelisteten PCR-Parametern.

2-stufiges Cycling-Verfahren (empfohlen)

Vorinkubation/Aktivierung 95 °C für 2 Minuten
PCR (40 Zyklen)
Denaturieren 95 °C für 5 Sekunden
Primerhybridisierung 60 °C für 30 Sekunden
(Erhebung von Fluoreszenzdaten)

3-stufiges Cycling-Verfahren (optional)

Vorinkubation/Aktivierung 95 °C für 2 Minuten
PCR (40 Zyklen)
Denaturieren 95 °C für 5 Sekunden
Annealing bei 60 °C für 15 Sekunden
Extension bei 70 °C für 15 Sekunden
(Erhebung von Fluoreszenzdaten)

Das Verwenden einer etwas höheren Hybridisierungstemperatur (63 °C) in dem zweistufigen Cycling-Verfahren kann die Spezifizität mancher Assays verbessern. Eine Schmelzkurvenanalyse ist optional. Die meisten microRNA RT-qPCR-Reaktionen erzeugen aufgrund der leichten Heterogenität der Länge des Poly(A)-Endes einen einzelnen, etwas breiteren Schmelzpeak des ersten Derivats, verglichen mit Reaktionen, die zwei genspezifische Primer verwenden.