Protokoll zur Bestimmung der qPCR-Effizienz

Optimierung der qPCR-Bedingungen

Die Optimierung der qPCR-Bedingungen ist wichtig für die Entwicklung eines robusten Assays. Anzeichen für eine schlechte Optimierung sind mangelnde Reproduzierbarkeit zwischen den Replikaten sowie ineffiziente und unempfindliche Assays. Die beiden wichtigsten Ansätze sind die Optimierung der Primerkonzentration und/oder der Hybridisierungstemperaturen.

Sobald ein Assay optimiert wurde, ist es wichtig, die Reaktionseffizienz zu verifizieren. Diese Informationen sind wichtig für die Berichterstattung und den Vergleich von Assays. In diesem Beispielprotokoll wird die Assay-Effizienz über einen breiten und einen engen dynamischen Bereich von cDNA-Konzentrationen verglichen. In der Praxis ist es üblich, abhängig vom erwarteten Zielbereich in den Proben einen einzelnen Testbereich auszuwählen, sodass das angegebene Protokoll entsprechend den Anforderungen des Experiments angepasst werden kann. In diesem Beispiel wird die Effizienz anhand von 10-fachen und 2-fachen Verdünnungsreihen berechnet. Die Standardkurve soll den erwarteten Expressionsbereich für die Gene von Interesse umfassen. Beachten Sie, dass die Proportionalität der cDNA-Ausbeute in Bezug auf die RNA-Eingabe bei Verwendung des ReadyScript^® RT-Kits linear ist, sodass dieses Experiment an die RT-qPCR angepasst werden kann, wenn dieses System verwendet wird, indem 1) die RNA verdünnt und die RT-Reaktionen durchgeführt werden und 2) anschließend die qPCR mit jeder der resultierenden cDNA-Proben durchgeführt wird (Beispiele siehe Reverse Transkription).  Dies ist jedoch nicht immer der Fall und gilt nicht für alle Reverse-Transkription-Kits oder -Protokolle. Es ist entsprechend zu überprüfen, bevor dieses Protokoll an ein anderes Kit angepasst wird 

Ausrüstung

• Gerät für die quantitative PCR
• Laminar-Flow-Werkbank für PCR-Setup (optional)

Reagenzien

• DNA, die als Template für die Standardkurve verwendet werden soll (z. B. cDNA, gDNA oder ein synthetisches Template).
• KiCqStart SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - abhängig vom Instrument, Tabelle P4-6).
• Wasser in PCR-Qualität: Wasser in PCR-Qualität (W1754 oder W4502) in 20 ml-Aliquoten; gefrieren; für jede Reaktion ein frisches Aliquot verwenden.
• Vorwärts- und Rückwärtsprimer für Testgene (Stammlösung bei 10 μM). 

Tabelle P17-42. Auswahlhilfe für SYBR^® Green PCR Mix™.

Hot Start ReadyMixes (Taq, Puffer, dNTP, Referenzfarbstoff, MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, (Art.-Nr. KCQS00)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox (Art.-Nr. KCQS01)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ mit ROX, (Art.-Nr. KCQS02)	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ für iQ, (;Art.-Nr. KCQS03)
Kompatible Geräte:	Kompatible Geräte:	Kompatible Geräte:	Kompatible Geräte:
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000	Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™	Fast Applied Biosystems ViiA 7	Applied Biosystems 7300	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™	Stratagene Mx3000P®	Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™	Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler®		Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480

Materialien

• Sterile Filter-Pipettenspitzen
• Sterile 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss (CLS430909)
• PCR-Röhrchen und -Platten. Eins auswählen, um das gewünschte Format zu erhalten:
  •    Einzelne dünnwandige 200 μl PCR-Röhrchen (Z374873 oder P3114)
  •    Platten
  - 96-Well-Platten (Z374903)
        - 384-Well-Platten (Z374911)
  •    Plattendichtungen
  - ThermalSeal RTS™ Dichtfilme (Z734438)
        - ThermalSeal RT2RR™ Film (Z722553)

Anmerkungen zu diesem Protokoll

• cDNA wird mit Hilfe von Zufalls-Priming oder der Oligo-dT-Methode erzeugt (siehe Standardprotokoll für die reverse Transkription (zweistufig)). Das RT-Produkt wird verdünnt, um die Standardkurven zu erstellen (als Beispiele werden 1:2 und 1:10 angegeben). RNA kann auch verdünnt und cDNA aus jeder Verdünnung mit dem ReadyScript^® Kit synthetisiert werden, oder es kann ein einstufiger RT-qPCR-Ansatz gewählt werden, indem die RNA verdünnt und der einstufige RT-qPCR-Ansatz im Protokoll der reversen Transkription (einstufiger SYBR^® Green I-Farbstoffnachweis) und dem Protokoll der reversen Transkription (einstufiger Sondennachweis) befolgt wird. Alternativ können die DNA-Templates so ersetzt werden, dass der erwartete C_q-Bereich zwischen C_q 15 und C_q 38 liegt.
• Jede Konzentration der seriellen Verdünnungen wird in Form von zweifachen Reaktionen durchgeführt.

Methode

1.    Bereiten Sie einen qPCR-Mastermix vor, der für 40 Reaktionen gemäß Tabelle P16-40 ausreicht. Dadurch können zusätzliche Pipettierfehler ausgeglichen werden, da 32 Reaktionen durchgeführt werden (Tabelle P16-41).

Tabelle P16-40. Reaktions-Mastermix für die Erstellung von 1:2- und 1:10-Standardkurven.

Reagenzien	Volumen (μl) pro 20 μl-Einzelreaktion	Volumen (μl) für 40 Reaktionen
2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	10	400
Vorwärtsprimer (10 μM)	0,9	36
Rückwärtsprimer (10 μM)	0,9	36
Wasser in PCR-Qualität	3,2	128

2.    Verdünnen Sie die DNA durch eine Serie von 1:10 und 1:2, wobei 7 Verdünnungspunkte für jede Serie abgedeckt werden (Tabelle P16-41, Plattenaufbau für die DNA-Verdünnung).

3.    Geben Sie 5 μl der entsprechenden Template-Verdünnung in die definierten Wells (Tabelle P16-41, Plattenlayout für DNA-Verdünnung).

Tabelle P16-41. Diagramm der ersten vier Spalten eines 96-Well-Plattenlayouts, in dem die Position der Verdünnungen des Standardkurven-Templates dargestellt wird. Die angegebene Verdünnung bezieht sich auf die ursprüngliche Stammlösung. Bei Verwendung eines künstlichen Templates ist es möglich, die Kopienzahl (relativ zu den OD-Messwerten) zu berechnen.

Plattenlayout für DNA-Verdünnung
Platte Säule	1	2	3	4	Verbleibende Platte
A	1	1	1	1
B	0,1	0,1	0,5	0,5
C	0,01	0,01	0,25	0,25
D	0,001	0,001	0,125	0,125
E	0,0001	0,0001	0,0625	0,0625
F	0,00001	0,00001	0,03125	0,03125
G	0,000001	0,000001	0,015625	0,015625
H	NTC	NTC	NTC	NTC

4.    Geben Sie 15 μl des Mastermix in jedes Well (Tabelle P16-41).

5.    Verschließen Sie die Röhrchen oder versiegeln Sie die Platte und beschriften Sie diese. (Vergewissern Sie sich, dass die Beschriftung nicht den Anregungs-/Detektionslichtweg des Instruments verdeckt)

6.    Lassen Sie die Proben gemäß dem folgenden zweistufigen Protokoll durchlaufen. Die Schritte 1-2 werden in 40 Zyklen wiederholt. Verfolgen Sie die Amplifikation mit einer Standard-Dissoziationskurvenanalyse.

Tabelle P16-42. PCR-Zyklusbedingungen für die Erstellung von Standardkurven.

Zyklusbedingungen	Temp. (ºC)	Zeit (s)
Anfängliche Denaturierung/Hot Start	95	30
Die Schritte 1-2 werden in 40 Zyklen wiederholt.
Schritt 1	95	5
Schritt 2	60	30

Hinweis: Verwenden Sie das Standardprotokoll für Dissoziationskurven (Datenerfassung).