Protokolle zur Kultur induzierter pluripotenter Stammzellen

• Einleitung
• Methoden
• Kryokonservierung humaner iPSC
• Tipps für die Fehlersuche
• Zugehörige Produkte 

Einleitung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) haben die Fähigkeit, differenzierte Nachkommen hervorzubringen, die über alle drei Keimschichten des Körpers verfügen: Ektoderm, Endoderm und Mesoderm. Die Fähigkeit, humane iPSC in vitro zu expandieren und sie zelltypspezifischen Differenzierungsprotokollen zu unterziehen, ist entscheidend für die Erzeugung Patienten-abgeleiteter Zellmodelle – "Krankheitsmodelle in der Petrischale“ – für die Stammzell-Grundlagenforschung und die Entdeckung von Wirkstoffen.

Dieser Protokollleitfaden beschreibt die Schritte für das Auftauen, Kultivieren und Kryokonservieren humaner iPSC, die von der European Bank of induced Pluripotent Stem Cells (EBiSC) bereitgestellt werden. Humane induzierte pluripotente Stammzelllinien (hiPSC) unterscheiden sich von allen anderen etablierten Zelllinien. Bitte lesen Sie die nachfolgenden Anweisungen sorgfältig, wenn Sie nicht mit der Kultivierung von iPSC vertraut sind.

Schlüsselpunkte für den Erfolg

• Lesen Sie diese Anweisungen sorgfältig, bevor Sie beginnen. Zu diesen Anweisungen gehören die Abschnitte über die erforderlichen Reagenzien, das Auftauen, die Passage, die Vorsichtsmaßnahmen und die Tipps zur Fehlerbehebung.
• Stellen Sie sicher, dass alle erforderlichen Reagenzien vor dem Auftauen der Zellen zur Verfügung stehen.
• Verwenden Sie die richtige Medien- und Matrixkombination. iPSC benötigen spezielle Medien und Kulturbedingungen.
• Stellen Sie sicher, dass Ihre Geräte regelmäßig kalibriert werden und keine Reagenzien abgelaufen sind.

Methoden

Das Analysenzertifikat (Certificate of Analysis, CofA) enthält Empfehlungen für das Auftauen von Zellen in Medien und Matrix, die für jede Zelllinie spezifisch sind. Wo erforderlich, können die verwendete Matrix und das Medium nur während der Passage durch eine Alternative ersetzt werden. Nach einem Wechsel des Mediums oder der Matrix benötigen die Zellen möglicherweise Zeit, um sich anzupassen. Es kann keine Garantie für die Viabilität oder Qualität der Zellen gegeben werden, wenn nicht das empfohlene Gewebekultursystem verwendet wird.

Vorbereitung der extrazellulären Matrix

Herstellung von Basalmembran-Extrakt (BME)

Stammzellen-qualifizierte EZM-Gelmatrix (CC131) ist ein löslicher Basalmembran-Extrakt (BME), der aus Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)-Tumoren aufgereinigt und für die Kultur von humanen ES/iPS-Zellen präqualifiziert wurde. Die Matrix polymerisiert bei 20-40 °C und bildet eine rekonstituierte Basalmembran. Das Produkt enthält Laminin, Kollagen IV, Entactin und Heparansulfat sowie andere EZM. Die Matrix macht ein zeitaufwändiges Vorscreening und eine Chargenidentifizierung überflüssig, bietet eine optimierte EZM-Beschichtung, die für die Langzeitkultur pluripotenter humaner ES/iPS-Zellen erforderlich ist, und unterstützt die Kultur humaner ES/iPS-Zellen in mehreren serumfreien/feeder-freien humanen ES/iPS-Zellexpansionsmedien (wie z. B. mTeSR^®, PluriSTEM™). Nachstehend finden Sie allgemeine Richtlinien für die Beschichtung von 6-Well-Platten mit der Stammzellen-qualifizierten EZM-Gelmatrix.  Alle Verfahren sollen unter aseptischen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Die EZM-Gelmatrix (CC131) einen Tag vor der Verwendung bei 2-8 °C im Kühlschrank auftauen. Nach dem Auftauen EZM-Gel durchgehend auf Eis lagern und vorgekühltes Medium und Pipetten verwenden, um ein Gelieren des Produkts zu vermeiden.
2. Die EZM-Gelmatrix (CC131) im Verhältnis 1:80 mit kaltem DMEM/F12 (D6421)-Medium verdünnen.  Das Volumen nach Bedarf vergrößern oder verkleinern.  Nachfolgend ein Beispiel für die Beschichtung einer 6-Well-Platte mit 1,5 ml 1:80 verdünntem EZM-Gel.
   Um eine 1:20-Verdünnung herzustellen, 0,5 ml EZM-Gel zu 9,5 ml kaltem DMEM/F12- oder DMEM-Medium in ein konisches 15-ml-Röhrchen geben.  Gesamtvolumen = 10 ml.
   Es ist eine weitere 4-fach-Verdünnung erforderlich, um die endgültige 1:80-Verdünnung zu erreichen.  2,5 ml 1:20 verdünntes EZM-Gel zu 7,5 ml kaltem DMEM/F12-Medium geben.  Gesamtvolumen = 10 ml
   HINWEIS: Die empfohlene Verdünnung beträgt 1:80, es kann jedoch auch ein konzentrierteres Stammzellen-qualifiziertes EZM-Gel verwendet werden.
3. 1,5 ml der 1:80 verdünnten EZM-Gelmatrix (CC131) in jedes Well einer 6-Well-Platte geben.  Die Kulturplatten schwenken, um die EZM-Gelmatrix gleichmäßig auf der Oberfläche der Platte zu verteilen.  Über Nacht oder mindestens 2 Stunden vor der Verwendung im Kühlschrank bei 2–8 °C aufbewahren.  Die Kulturplatten in Parafilm einwickeln und bis zur Verwendung bei 2–8 °C lagern, wenn die EZM-beschichteten Kulturplatten nicht sofort verwendet werden. Die mit EZM beschichteten Kulturplatten innerhalb von 3-4 Tagen verwenden.
4. Vor dem Aussäen der Zellen die Platte 10-15 Minuten auf Raumtemperatur bringen, die Beschichtungslösung entfernen und 3 ml/Well humanes ES/iPSC-Wachstumsmedium (SCM130) hinzufügen. Die Zellen können nun auf den neu beschichteten Platten ausgestrichen werden.

WICHTIG:  Die Platten nicht austrocknen lassen.

Herstellung von Vitronectin

1. Vitronectin (CC130) nach Erhalt bei -80 °C lagern. Vor der Verwendung das Vitronectin-Vorratsröhrchen bei Raumtemperatur auftauen und 60-μl-Aliquote in sterilen Polypropylenröhrchen herstellen. Die Aliquote bei -80°C einfrieren oder sofort verwenden. Ein 60 μl-Aliquot reicht für die Beschichtung aller Wells einer 6-Well-Platte aus.
2. Um Vitronectin in einer Arbeitskonzentration von 0,5 μg/cm² herzustellen, das Vitronectin 1:100 verdünnen, indem 6 ml PBS (D8537), das in Raumtemperatur vorliegt, vorsichtig mit 60 μl Vitronectin gemischt werden. 1 ml verdünntes Vitronectin in jedes Well einer 6-Well-Platte geben.
3. Die beschichteten Kulturgefäße bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubieren. Falls eine Lagerung erforderlich ist, können die Gefäße mit Parafilm^® (P7793) versiegelt und bis zu 3 Tage bei 2-8 °C gelagert werden. Das Gefäß vor der Verwendung 1 Stunde auf Raumtemperatur äquilibrieren lassen.
4. Das überschüssige Vitronectin aus dem Kulturgefäß entnehmen und entsorgen, um das Gefäß für die Kultur vorzubereiten. Es ist nicht notwendig, das Kulturgefäß nach der Entfernung von Vitronectin zu waschen.

Herstellung von Zellkulturmedien

mTeSR™-1 Medien

1. Bei Bedarf das mTeSR™1 Supplement (5x) aus dem Gefrierschrank nehmen und vor der Verwendung über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Nicht bei 37 °C auftauen.
2. Aseptisch 100 ml mTeSR™1 Supplement (5x) zu 400 ml kaltem (2-8 °C) Basalmedium hinzufügen.
3. Das Medium in Volumina aliquotieren, die für eine Woche Kulturarbeit erforderlich sind.
4. Vollständiges mTeSR™1 kann bei 2-8 °C für 1 Woche oder bei -20 °C für 6 Monate aufbewahrt werden. Gefrorenes vollständiges mTeSR™1 kann einmal aufgetaut werden. Medium nicht wiederholt gefrieren und auftauen. mTeSR™1 vor der Verwendung auf Raumtemperatur aufwärmen. Das Medium nicht länger als 2 Stunden pro Tag bei Raumtemperatur stehen lassen und Lichteinwirkung vermeiden, um einem Abbau der Medienbestandteile vorzubeugen.

Essential 8™ (TeSR™-E8) Medien

1. Bei Bedarf das E8-Supplement (50x) aus dem Gefrierschrank nehmen und vor der Verwendung über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Nicht bei 37 °C auftauen.
2. Aseptisch 10 ml des E8-Basalmediums entnehmen, sodass 490 ml übrig bleiben.
3. 10 ml E8-Supplement (50x) zu den 490 ml des kalten Basalmediums (2-8 °C) hinzugeben.
4. Das Medium in Volumina aliquotieren, die für eine Woche Kulturarbeit erforderlich sind.
5. Vollständiges E8 kann bei 2-8 °C 1 Woche oder bei -20 °C 6 Monate aufbewahrt werden. Gefrorenes vollständiges E8 kann einmal aufgetaut werden. Medium nicht wiederholt gefrieren und auftauen. E8 vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmen. Das Medium nicht länger als 2 Stunden pro Tag bei Raumtemperatur stehen lassen und Lichteinwirkung vermeiden, um einem Abbau der Mediumbestandteile vorzubeugen.

PluriSTEM^® Humane ES/iPSC-Medien

PluriSTEM^® Medium (SCM130, SCM132) ist ein vollständiges serumfreies Medium auf Basis niedermolekularer Verbindungen, das eine feeder-freie Kultur humaner ES/iPS-Zellen ermöglicht und einen Medienwechsel an jedem zweiten Tag erlaubt, ohne die Morphologie oder die langfristige Funktionalität zu beeinträchtigen. Die Medien sind vollständig, ein Hinzufügen von Supplementen ist nicht erforderlich. Bei Bedarf das Medium aus dem Gefrierschrank nehmen und vor der Verwendung über Nacht bei 2-8 °C auftauen. Nicht bei 37 °C auftauen. Nach dem Auftauen sollen PluriSTEM^® Medien bei 2-8 °C gelagert und innerhalb von zwei Wochen verwendet werden.

 

Auftauen humaner iPSC

1. Die Zellen sollen schnell aufgetaut werden, indem das Kryogefäß in ein Wasserbad mit einer Temperatur von 37 °C gestellt wird. Das Kryogefäß vorsichtig im Wasserbad schwenken, um ein schnelles Auftauen sicherzustellen, dabei den Deckel des Kryogefäßes nicht eintauchen. Das Kryogefäß vor dem Öffnen mit Ethanol 70 % (793213) oder einem gleichwertigen Desinfektionsmittel desinfizieren.
2. Mit einer sterilen 5-ml-Pipette das Gemisch aus Kälteschutzmittel und Zellen aus dem Kryoröhrchen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Darauf achten, dass die Zellen nicht physisch beschädigt werden.
3. Langsam, Tropfen für Tropfen, 10 ml des geeigneten Mediums bei Raumtemperatur zu den Zellen im 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Das 15-ml-Zentrifugenröhrchen vorsichtig nach vorne und hinten schaukeln und dabei das Medium tropfenweise hinzufügen. Dies ist ein entscheidender Schritt, durch den der osmotische Schock für die Zellen minimiert wird und der dazu beiträgt, die Zellen so schonend wie möglich zu behandeln.
4. Das Röhrchen überprüfen, um sicherzustellen, dass der gesamte Zelleninhalt entfernt wurde. Falls erforderlich, mit 1 ml eines geeigneten Mediums spülen.
5. Für eine Zellzählung kann eine kleine Zellmenge verwendet werden. Eine einzelne Zellsuspension soll mit Trypsin oder einem anderen geeigneten Zellablösungsmedium hergestellt werden. Als allgemeine Richtlinie gilt für ein Well einer 6-Well-Platte eine Aussaatdichte von 2x10⁵ - 1x10⁶ viabler Zellen. Die Richtlinien für eine spezifische EBiSC-Zelllinien-Chargennummer sind im Analysenzertifikat (CofA) enthalten.
6. Die Zellen bei 200 x g 2 Minuten zentrifugieren. Den Überstand entfernen und verwerfen.
7. Die Kulturgefäße vorbereiten, indem eine angemessene Menge Medium hinzugefügt wird (z. B. 1,5 - 2 ml pro Well einer 6-Well-Platte).
8. Vorsichtig auf das 15-ml-Zentrifugenröhrchen klopfen, um das Zellpellet zu lösen, danach vorsichtig 1 ml eines geeigneten Mediums hinzufügen und in 2 Wells einer beschichteten 6-Well-Platte aussäen (anpassen, wenn andere Kulturformate verwendet werden oder eine andere Empfehlung im Analysenzertifikat vorliegt). Die Zellen nicht überaspirieren, da dies zu einer verringerten Viabilität aufgrund des Entstehens einer einzelnen Zellsuspension führt.
9. Die Platte vorsichtig nach links und rechts und vorwärts und rückwärts schwenken, um die Zellen gleichmäßig im Well zu verteilen.
10. Es wird empfohlen, unmittelbar nach dem Auftauen, nach 48 Stunden und bei etwa 70-80 % Konfluenz Bilder der Zellen aufzunehmen.

 

Kultivierung humaner iPSC

1. Es wird empfohlen, die iPSC-Linien täglich unter dem Phasenkontrastmikroskop (4-fache, 10-fache, 20-fache und 40-fache Vergrößerung) zu beobachten, um die iPSC-ähnliche Morphologie, das Vorhandensein differenzierter Zellen und die Konfluenz zu überprüfen. Ein typisches Scoring ist nachstehend aufgeführt:

Qualität	Beschreibung
A	Optimale, verdichtete iPSC-Kolonien mit definierten Rändern; einheitliche Morphologie in allen Kolonien
B	Akzeptable iPSC-Kolonien mit einer gewissen Differenzierung an den Rändern, Zellen innerhalb der Kolonien lockerer gepackt
C	Gute Adhärenz und kleine entstehende iPSC-Kolonien
D	Schlechte Adhärenz und keine offensichtlichen iPSC

Abbildung 1. Bewertung von iPSC-Kolonien

Abbildung 2. Differenzierungsebenen innerhalb von iPSC-Kulturen

2. Die Zellen werden gefüttert, indem ca. 95 % des Mediums mit einer Saugpipette aus den Wells entnommen werden. Das Medium nicht vollständig entfernen; ein dünner Film des Mediums soll die Zellschicht bedecken, um ein Austrocknen der Zellen zu vermeiden.
3. Aseptisch je 2 ml frisches Medium pro Well einer 6-Well-Platte durch vorsichtiges Hinzufügen am Rand des Wells hinzugeben. Zellen bei 37 °C/ 5 % CO₂ inkubieren.
4. In der Regel wird das Medium täglich an sechs von sieben Tagen ausgetauscht, wobei das Volumen des Mediums erhöht wird (1,5x bis 2x der normalen Menge; abhängig von der Zelldichte), wenn die Zellen zwischen den Medienwechseln länger belassen werden müssen. Zwischen den Medienwechseln sollen nicht mehr als zwei Tage liegen.

Passage humaner iPSC

Passage-Protokoll für EZ-LiFT™ Reagenzien

1. Das EZ-LiFT™ Reagenz (SCM139) vor dem Beginn auf 37 °C erwärmen.
2. Das Nährmedium absaugen und die Wells zweimal mit 1,5 ml EZ-LiFT™-Reagenz (SCM139) waschen.
3. 1 ml EZ-LiFT™ Reagenz (SCM139) in jedes Well geben.  Die Platten bei einer Temperatur von 37 °C 4 Minuten inkubieren. 
4. Nach 4 Minuten schnell auf den Boden der Platte klopfen (d. h. in 5 Sekunden 20-25 mal klopfen). 
5. Die Platte weitere 4 Minuten in den 37 °C-Inkubator zurücklegen.
6. Nach 4 Minuten schnell auf den Boden der Platte klopfen (d. h. in 5 Sekunden 20-25 mal klopfen).
7. Eine schnelle Prüfung des Wells/der Wells mit dem Mikroskop durchführen.
   1. Wenn eine erhebliche Anzahl abgelöster Klumpen sichtbar ist, mit Schritt 8 fortfahren.
   2. Wenn keine offensichtliche Ablösung zu beobachten ist, die Schritte 4-7 wiederholen, mit der Ausnahme, dass in Schritt 5 die Inkubation bei 37 °C nur 2 statt 4 Minuten andauern soll.  Mit Schritt 8 fortfahren.
8. Die Zellsuspension (~1 ml) vorsichtig auffangen und in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen.  Mit 5 ml Nährmedium neutralisieren, indem das Medium vorsichtig zur Zellsuspension gegeben wird.  Nicht auf und ab pipettieren, da dies die Zellklumpen in eine Einzelzellsuspension aufbrechen könnte.
9. Bei 800 U/min 3 Minuten zentrifugieren. Den Überstand absaugen.
10. Das Zellpellet vorsichtig in 1 ml Medium, das die Pluripotenz unterstützt, resuspendieren, wie z. B. PluriSTEM^® (SCM130).  Nicht mehr als zweimal auf- und abpipettieren.  Übermäßiges Pipettieren kann zur Dissoziation in einzelne Zellen führen. 
11. Die dissoziierten Zellklumpen in neu beschichtete 6-Well-Platten geben. Das Aufteilungsverhältnis soll zwischen 1:6 und 1:30 liegen. Die Zellen täglich kontrollieren. Die Zellen erreichen abhängig vom Teilungsverhältnis in der Regel nach 6-8 Tagen eine Konfluenz von 60-80 %.

Accutase-Passage-Protokoll

1. Ausreichend PluriSTEM^® (SCM130), Accutase (A6964) und DMEM/F12 (D6421) für die Passage der Zellen aliquotieren. Die Reagenzien bei Raumtemperatur erwärmen.
2. Eine Stunde vor der Passage der Zellen den ROCK-Inhibitor (ROCKi), Y-27632 (SCM075) in einer Endkonzentration von 10 μM in jedes Well der 6-Well-Platte geben.
3. Nach einer Stunde die Platte mit den zu passagierenden pluripotenten Zellen mit einem Seziermikroskop visuell untersuchen. Bereiche mit spontaner Differenzierung entfernen.
4. Das Medium mit den Zellen aus den abgeschabten Bereichen des Wells absaugen. Mit 2 ml DMEM/F-12-Medium (D6421) oder 1X PBS (D8537) pro Well spülen.
5. Absaugen und durch 1 ml Accutase (A6964) pro Well einer 6-Well-Platte ersetzen. Bei 37 °C 8–10 Minuten inkubieren.
6. Die Accutase-Reaktion durch Zugabe von 1 ml PluriSTEM^® Medium (SCM130) für jeden ml der verwendeten Accutase quenchen. Die Zellen vorsichtig mit einer sterilen 1000-μl-Pipettenspitze ablösen.
7. Die dissoziierten Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen sammeln. Die Wells mit weiteren 2 ml PluriSTEM^® Medium (SCM130 spülen, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Die Spülung in das konische 15-ml-Röhrchen überführen.
8. Das konische 15-ml-Röhrchen mit der Zellsuspension bei 300 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.
9. Den Überstand absaugen. Die Zellen in frischem PluriSTEM^® Medium (SCM130) mit 10 μM ROCK-Inhibitor Y-27632 (SCM075) resuspendieren.
10. Die Anzahl der Zellen mit einem Scepter™ Zellzähler oder einem Hämozytometer zählen. Sicherstellen, dass die Zellen in einer Einzelzellsuspension vorliegen. Die Zellviabilität durch Trypanblau-Ausschluss (T8154) bestimmen.
11. Eine Titration mit verschiedenen Zelldichten von 0,5 –1x10⁴ Zellen/cm² durchführen. Dies entspricht 50.000–100.000 Zellen pro Well einer Matrigel-beschichteten 6-Well-Platte in PluriSTEM^® Medium mit 10 μM ROCK-Inhibitor.
12. Am nächsten Tag durch frische PluriSTEM^® Medien (SCM130) ersetzen. Alle 2 Tage durch frisches PluriSTEM^®-Medium (SCM130) ersetzen (3 ml Volumen pro Well). Die Zellen können alle 5–7 Tage passagiert werden.

Dispase Passage-Protokoll

1. Ausreichend Dispase II, 1 mg/ml (CC130) und DMEM/F12 (D6421) für die Passage der Zellen aliquotieren. Die Reagenzien bei Raumtemperatur erwärmen.
2. Ein Präparationsmikroskop einsetzen, um die Platte mit den zu passagierenden humanen pluripotenten Zellen visuell zu untersuchen. Die Kolonien auf Bereiche mit spontaner Differenzierung untersuchen.
3. Eine sterile p200-Pipettenspitze, die an einem p200 Pipetman angebracht ist, einsetzen, um Bereiche mit spontaner Differenzierung abzuschaben.
4. Das Medium mit den Zellen aus den abgeschabten Bereichen des Wells absaugen. Mit 2 ml DMEM/F-12-Medium (D6421) oder 1X PBS (D8537) pro Well spülen.
5. 1 ml Dispase II, 1 mg/ml (CC130) pro Well der 6-Well-Platte mit den zu passagierenden pluripotenten humanen ES- oder iPS-Zellen hinzufügen.
6. Bei 37 °C 6–7 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation die Kolonien unter dem Mikroskop visuell untersuchen. Die Ränder der Kolonien können leicht abgerundet und/oder von der Plattenoberfläche weggeklappt erscheinen, der Großteil der Kolonie sollte jedoch noch an der Platte haften.
7. Dispase II (CC130) absaugen und jedes Well zweimal vorsichtig mit 2 ml 1X PBS (D8537)- oder DMEM/F12 (D6421)-Medium spülen.
8. 1,5-2 ml PluriSTEM^® Medium (SCM130) in jedes Well geben. Die Kolonien vorsichtig mit einem Zellschaber ablösen.
9. Eine serologische 5-ml-Pipette verwenden, um die Zellaggregate in einem konischen 15-ml-Röhrchen zu sammeln. So wenig wie möglich Auf- und Abpipettieren, da dadurch die Kolonien in suboptimale kleine Stücke zerfallen können.
10. Die Wells mit zusätzlichen 2 ml PluriSTEM^® Medium (SCM130) pro Well spülen, um alle verbleibenden Zellaggregate aufzufangen. Die Spülung in das konische 15-ml-Röhrchen überführen.
11. Das konische 15-ml-Röhrchen mit den Zellaggregaten bei 300 x g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren.
12. Den Überstand absaugen. Die Zellaggregate in einem geeigneten Volumen PluriSTEM^® Medium (SCM130) für die Passage resuspendieren. Die Zellen abhängig von der Anzahl der Zellklumpen im Verhältnis 1:3 bis 1:6 aufteilen.
13. Die Platte in einen 37 °C Inkubator legen. Die Platte vorsichtig von einer Seite zur anderen und vorwärts und rückwärts bewegen, um sicherzustellen, dass die Zellaggregate gleichmäßig über die Oberfläche des Wells verteilt werden.
14. Am nächsten Tag durch 3 ml frisches PluriSTEM^® Medium (SCM130) pro Well ersetzen. Die Zellen können alle 5–7 Tage passagiert werden.

Kryokonservierung humaner iPSC

1. Reagenzien und Gefrierbehälter (z. B. Mr. Frosty) während des Kryokonservierungsverfahrens gekühlt halten.
2. Die Zellen müssen in der exponentiellen Wachstumsphase (log) kryokonserviert werden, um die Überlebenschance beim Auftauen zu verbessern. Der optimale Zeitpunkt für die Ernte ist in der Regel, wenn die Zellen zu etwa 70-80 % konfluent sind
3. Die Art des verwendeten Kälteschutzmittels hängt von den Kulturbedingungen und Präferenzen des Labors ab. Entweder das handelsübliche Cryostor^® CS10 (C2874) oder eine Gefriermischung auf DMSO-Basis (D2650) (10 % DMSO in FBS und Nährmedium) einsetzen. Das Cryostor^® Medium wird gebrauchsfertig geliefert und bei 2-8 °C gelagert. Zur Herstellung eines DMSO-basierten Kälteschutzmittels 40 % FBS mit 10 % DMSO mischen, danach mit 50 % eines geeigneten Mediums mischen.
4. Das verbrauchte Medium aus dem Gewebekulturgefäß entnehmen und das Gefäß zweimal mit dem empfohlenen Volumen an Waschpuffer abhängig von den Kulturbedingungen waschen (Waschpuffer für Cultrex/Matrigel ist 0,5 mM EDTA; Waschpuffer für Vitronectin ist PBS).
5. Um die Zellen aus dem die Gewebekultur umgebenden Kunststoff zu lösen, 1 ml 0,5 mM EDTA (03690) in das Gewebekulturgefäß geben. Die Zellen abhängig von der verwendeten Matrix über den empfohlenen Zeitraum bei der empfohlenen Temperatur inkubieren. Das EDTA aus dem Well absaugen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Kolonien nur sehr lose auf dem Kunststoff anhaften.
6. Pro Well 1 ml Kälteschutzmittel hinzufügen. Das Kälteschutzmittel mit einer sterilen 1-ml-Pipette vorsichtig über dem Gefäß waschen, um die Zellen vom Kunststoff zu lösen. Nicht mehr als 3 Mal absaugen, um zu vermeiden, dass die Zellklumpen in einzelne Zellen zerfallen. Das Kälteschutzmittel und das Zellgemisch in ein entsprechend gekennzeichnetes Kryoröhrchen geben.
7. Wenn die Kryokonservierung mehrerer Wells gewünscht ist, sollen Zellen mit der gleichen Passagenanzahl und den gleichen Kulturbedingungen gepoolt werden. Für eine Zellzählung kann ein Aliquot der gepoolten Zellen verwendet werden. Die geernteten Zellen 2 Minuten bei 200xg zentrifugieren, das verbrauchte Medium absaugen und das Zellpellet vorsichtig in einem angemessenen Volumen Kälteschutzmittel resuspendieren. In einem Well einer 6-Well-Platte befinden sich etwa 1-2 x 10⁶ Zellen. Es wird empfohlen, etwa 1-2 x 10⁶ Zellen pro Kryoröhrchen einzufrieren. 1 ml Kälteschutzmittel-Zellgemisch pro Kryoröhrchen verwenden.
8. Die Kryoröhrchen sofort in einen vorgekühlten (2-8 °C) Mr. Frosty-Behälter geben und diesen sofort in einen -80°C Gefrierschrank stellen. Die Zellen über Nacht (16-36 Stunden) bei -80 °C stehen lassen. Sobald die Zellen gefroren sind, werden sie auf Trockeneis in ein Gefäß für die Lagerung bei extrem niedrigen Temperaturen (flüssiger Stickstoff oder -150°C Gefrierschrank) überführt.

Charakterisierung humaner iPSC

Der undifferenzierte Zustand der iPSC ist durch eine hohe Expression alkalischer Phosphatase (SCR004) und der Stammzell-Transkriptionsfaktoren Nanog, Oct-4 und Sox-2 gekennzeichnet. Diese Zellen unterscheiden sich auch deutlich von ihren murinen Pendants in Bezug auf die Expression stadienspezifischer embryonaler Antigene (SSEA1, 3, 4) und Podocalyxin (TRA-1-60, TRA-1-81). Die Zellen können mittels Antikörper-ICC-Färbung unter Verwendung von Kits für die Stammzellcharakterisierung (SCR001, SCR002, SCR078) oder durch PCR-Analyse analysiert werden.

Tabelle 1. Zusammenfassung humaner iPSC-Marker

Zelltyp	Alkalische Phosphatase	Oct-4	Sox-2	Nanog	SSEA-1	SSEA-4	TRA-1-60	TRA-1-81
Humane iPSC	+	+	+	+	-	+	+	+
Maus iPSC	+	+	+	+	+	-	-	-

Abbildung 3. Pluripotente iPS-Zellen exprimieren pluripotente Marker. Alkalische Phosphatase (40x) (A), Oct-4 Alexa 488 (MAB4401A4, 400x) (B), Sox-2 Cy3 (MAB4423C3, 100x) (C), Nanog Alexa 488 (MABD24A4, 400x) (D), TRA-1-60 Cy3 (MAB4360C3, 100x) (E) und TRA-1-81-Cy3 (MAB4381C3, 100x) (F). Die Zellkerne wurden mit DAPI (blau) (D9542) gegengefärbt.

 

Tipps für die Fehlersuche

Problem	Beobachtung	Lösung
Geringe Viabilität von iPSC nach dem Auftauen	• Wenige bis keine Kolonien innerhalb von 4 Tagen nach Wiederfindung sichtbar	• Sicherstellen, dass die Kryoröhrchen schnell aufgetaut werden und dass das Medium sehr langsam zu den Zellen gegeben wird (tropfenweise unter leichtem Schwenken des Röhrchens) • 10 μm ROCK-Inhibitor beim Auftauen zugeben, aber nicht routinemäßig verwenden • Sicherstellen, dass die Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase (log) mit geringem Differenzierungsgrad in Banken gezüchtet wurden • Kleine Kolonien wachsen lassen, bis sie robust sind, und bei niedrigem Teilungsverhältnis (1:1 oder 1:2) passagieren
Geringe Viabilität nach der Passage	• Zellen haften nicht richtig • Atypische Morphologie • Hohe Zellsterblichkeit • Zellen vermehren sich nicht	• Ein niedrigeres Teilungsverhältnis einsetzen und eine konfluentere Kultur aufrechterhalten • Sicherstellen, dass sich die Zellen bei der Passage in der exponentiellen Wachstumsphase befinden • Zügig arbeiten oder die EDTA-Inkubationszeit verkürzen, da die Klumpengröße durch eine zu lange Exposition gegenüber EDTA beeinflusst werden könnte • Die EDTA-Inkubationszeit erhöhen, wenn sich die Zellen nur schwer ablösen. Damit soll vermieden werden, dass die Zellen zu heftig gespült werden und dadurch zu kleine Aggregate oder eine Einzelzellsuspension entstehen • Überprüfen, ob die Platten ordnungsgemäß beschichtet wurden, ob die Matrix das Verfallsdatum noch nicht überschritten hat, und die Charge durch Kontakt mit dem Hersteller überprüfen, wenn dieses Problem regelmäßig auftritt und andere Gründe ausgeschlossen werden konnten
Spontane Differenzierung	• Kolonien haben keine definierten Ränder • Zellen innerhalb der Kolonien sind weniger kompakt • Zellen erscheinen abgeflacht und groß oder fibroblastisch	• Sicherstellen, dass die Zellen gemäß den Empfehlungen kultiviert werden (d. h. tägliche Fütterung der Zellen) • Sicherstellen, dass die Reagenzien frisch zubereitet werden (d. h. innerhalb von zwei Wochen verwendet werden) • Die Platten nicht außerhalb des Inkubators stehen lassen, um Temperaturschwankungen und Lichteinwirkung zu minimieren. • Verringern der Koloniedichte durch Ausstreichen einer geringeren Anzahl Zellaggregate pro cm2 während der Passage • Wenn gute iPSC-Kolonien zwischen differenzierten Bereichen bestehen bleiben, kann eine manuelle Entnahme von Kolonien mit guter iPSC-Morphologie mit einer Pipettenspitze in Betracht gezogen werden. Es wird empfohlen, mehrere Kolonien auszuwählen und sie mit einer Pipettenspitze aufzuteilen, sie anzuheben, zu aspirieren und dann in ein neues 1:6-Well zu geben • Die Entfernung der differenzierten Zellen durch Abschaben der differenzierten Bereiche mit einer Pipettenspitze bei intakt verbleibenden iPSC-Kolonien kann in Betracht gezogen werden. Dabei muss darauf geachtet werden, dass die iPSC-Kolonien nicht gestört werden und bei diesem Verfahren nicht zu viel von der Matrixschicht abgekratzt wird
Ungleichmäßige Verteilung der Kolonien auf der Platte	• Bereiche, in denen die Dichte der iPS-Zellen höher ist, als die Dichte von IPS-Zellen sein sollte. Signifikante Bereiche der Plattenoberfläche weisen wenige bis keine Kolonien auf	• Sicherstellen, dass die gesamte Oberfläche des Gewebekultur- Gefäßes gleichmäßig mit der entsprechenden Matrix beschichtet ist • Sicherstellen, dass die Zellaggregate gleichmäßig verteilt sind, indem die Platte vorsichtig vor- und zurück und von einer Seite zur anderen bewegt wird • Die Platte vorsichtig in den Inkubator stellen und   ungestört 24 Stunden stehen lassen
Es ist erhebliches Kratzen erforderlich, um die Zellen zu entfernen	• Die Kolonien lösen sich nicht von der Platte, nachdem sie 2- 3 Mal mit einer 1-ml-Pipette gespült wurden	• Sicherstellen, dass Inkubationszeit und Temperatur von EDTA und Matrix übereinstimmen • Die Inkubationszeit von EDTA erhöhen • Eine Konfluenz der Zellen von mehr als 70 % vermeiden • Übermäßiges Wachstum innerhalb der Kolonien vermeiden. Manchmal ist es notwendig, eine weniger konfluente Platte mit einer geringeren Anzahl robuster Kolonien zu passagieren, indem ein niedrigeres Teilungsverhältnis eingesetzt wird
Schlechte Anhaftung und erheblicher Anstieg des Zelltods nach der Passage	• Die Zellen beginnen, sich von der Platte zu lösen, obwohl sie sofort nach der Passage zu haften schienen	• Statt eines Medienaustauschs die Wells mit frischem Medium auffüllen, um eine ausreichende Nährstoffkonzentration zu gewährleisten. Die Zellen weitere 24 Stunden ungestört belassen, damit die Aggregate vollständig anhaften können • Medium sehr vorsichtig austauschen. Kolonien nicht durch rasche Zugabe von Medium übermäßigen Scherkräften aussetzen