FLAG^® HA 系統

蛋白質複合物的分離和分析仍然是功能蛋白組學研究中的一大技術挑戰。共免疫沉淀是分离蛋白质复合物最广泛使用的方法。TAP (串聯親和純化) 方法將串聯親和標籤整合到目標蛋白中，以拉取和分離內源互作蛋白。與單一純化相比，使用 TAP 方法分離的蛋白質複合物具有更高的純度。

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FLAG^® HA系統概述

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FLAG^® HA串聯表位系統由非真核生物衍生的小表位標籤組成。這些特性可將對蛋白功能的干擾降至最低，並提供優異的特異性。FLAG^® HA勝肽的親水特性增加了雙表位位於融合蛋白表面的可能性，抗體與抗原可在此互動。

其他的 TAP 系統，包括 GST、clamodulin、鎳結合蛋白、streptavidin 和 Protein A 的組合，都有幾個限制，例如：由於相對較大的 TAP 標籤 (20 KD 或更大)，會干擾複合物的組合或蛋白功能；非靶向的內源蛋白污染率高；以及需要 TEV 蛋白酶處理來洗脫，增加了額外的細菌污染物。

FLAG^® HA系統的主要特點

• 與現有系統相比，親和樹脂具有高特異性，拉下的污染物更少

• 親和樹脂具有高特異性，與現有系統相比，拉取的雜質更少

圖 1. FLAG® HA 串聯親和純化系統示意圖。整個程序包括六個簡單步驟1) 準備含有 FLAG® HA 標記誘導蛋白的起始材料；2) 將 EZView ANTI-FLAG® 樹脂直接添加到裂解液中；3) 將樹脂轉移到旋轉柱上並進行清洗；4) 用 3X FLAG® 多肽進行第一次洗脫；5) 將第一次洗提液直接轉移到含有抗 HA 親和樹脂的旋轉柱上，結合並洗滌；以及 6) 根據下游操作（尿素、HA 肽或 Laemmli Sample Buffer）使用洗滌緩衝液進行第二次洗滌。

支援資料

圖 2. 使用植物材料的 FLAG^® 和 HA 標籤及親和樹脂的特異性分析。面板 A 顯示 ANTI-FLAG^® 和抗 HA 抗體分別對 7 種不同植物萃取物 (煙草、拟南芥、玉米、大豆、水稻、番茄和棉花) 中的 FLAG^® 和 HA 標籤融合蛋白的高特異性。使用 ANTI-FLAG M2^®-AP 和 anti-HA-HRP 抗體結合物進行免疫印圖檢測。面板 B 顯示 ANTI-FLAG^® 和抗-HA 樹脂與現有樹脂 (ANTI-FLAG^®、抗-HA、蛋白質 G、CBP、Streptavidin、鎳和谷胱甘肽) 比較的特異性。洗滌後，洗出與樹脂非特異性結合的蛋白質，在 PAGE 凝膠上解析，並以銀染色檢測。與其他樹脂相比，ANTI-FLAG^®和抗HA樹脂的交叉反應極少。面板 C 顯示與單次免疫沉淀相比，連續免疫沉淀可提供高純度的樣品。

圖 3. 利用哺乳類動物細胞中著名的蛋白質-蛋白質互作系統 p53 和 T-antigen 來表征 FLAG^® HA 系統。使用 FLAG^® HA Tandem TAP Tag Generation Kit (TP0020) 將 FLAG^® HA 串聯標籤納入 p53 並在 COS-7 哺乳動物細胞中瞬間表達。作為誘餌蛋白的標記 p53 與內源 T 抗原相互作用形成複合物。使用 TAP 程序分離蛋白複合物。圖中說明 FLAG^® HA 不會干擾互作。在這種情況下，使用尿素基洗提液優先洗提 T 抗原。使用 3X FLAG^® 多肽洗脱时，两种蛋白从树脂中的洗脱率相同。洗脱条件因所用蛋白和表达系统而异。不同的應用和下游分析需要優化洗脫條件。