Western Blotting：為什麼觀察到的分子重量和計算出的分子重量不同？
Chandra Mohan, Ph.D., Wayne Speckmann, Ph.D.
圖 1.糖基化人類谷氨酰胺環化酶的結構 (PDB 3SI0)1
Western印跡是一種廣泛使用的實驗室方法，用於檢測組織勻質物或細胞裂解物中的特定蛋白質分子。通常，它包括用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 分離蛋白質，轉移到固體支持物 [聚偏二氟乙烯 (PVDF) 或硝酸纖維膜]，然後用抗體檢測感興趣的蛋白質。蛋白質的大小可透過電泳分離來判斷 - 較小的蛋白質會比較大的蛋白質遷移得快。
蛋白質的計算（或預測）分子量是將給定蛋白質中各個氨基酸的實際分子量相加而得到的。計算出的分子量偶爾會與 Western 印跡上觀察到的分子量不同。有幾個因素會造成觀察到的分子量和計算出的分子量之間的差異。
蛋白質淨電荷
在 SDS-PAGE 中，與十二烷基硫酸鈉 (SDS) 的負電荷相比，蛋白質的本質電荷基本上可以忽略不计。在施加恆定電場時，蛋白質（被帶負電的 SDS 包覆）會向陽極移動。較小的分子會比受到聚丙烯酰胺凝膠限制的較大分子移動得更快。然而，在蛋白質含有大量精氨酸或賴氨酸殘基的罕見情況下，蛋白質仍帶有正電荷。這可能會影響 SDS 的結合，並影響蛋白質在凝膠中的移動，造成觀測分子量與計算分子量之間的差異。
糖基化
幾種蛋白質會進行糖基化，糖分子會以共價方式附著在多肽鏈上。真核生物中最常見的兩種糖基化類型是N-連結糖基化（天冬酰胺上的糖基化），以及O-連結糖基化（絲氨酸或蘇胺酸上的糖基化）。廣泛的糖基化會減緩蛋白質在 SDS-PAGE 中的移動。
磷酸化
最常見的翻譯後修飾之一是磷酸化，它可以發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基上。雖然單一磷酸化基團的加入對分子量的影響很小，通常也超出了標準 SDS-PAGE 的解析度，但是多個位點的磷酸化會導致更明顯的分子量變化。
泛素化
泛素是一種小蛋白質（76 個氨基酸，分子量為 8.6 kDa），幾乎在所有組織類型中都有表達。它透過三個酵素級聯（E1、E2 和 E3）催化的酵素反應，與賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸共價結合，或直接與蛋白質 N 端結合。蛋白質可能是單泛素化或多泛素化。這有助於觀察蛋白質的分子量。
蛋白質複合物和聚集體
在 SDS-PAGE 中，電泳是在變性條件下進行的。在樣品製備和電泳過程中，大多數蛋白質複合物（由透過非共價鍵連結的蛋白質組成）會解離，而組成蛋白則以單體形式進行電泳。然而，有些複合物可能不會完全解離，有些蛋白質即使在 SDS 和 β-mercaptoethanol 的存在下，仍可能以同源或異源複合物的形式存在。在這些情況下，觀察到的分子量可能遠高於預測的單體重量。有些蛋白質，尤其是跨膜蛋白質和具有疏水結構域的蛋白質，在細胞溶解過程中也會聚集，因為它們會從原生蛋白複合物和脂質膜中釋放出來。這些聚集體會顯示較高的分子量，而且可能不代表在其原生狀態下所發生的互動。
非特异性蛋白水解裂解和蛋白降解
在組織均質化或細胞裂解過程中破壞細胞膜會釋放蛋白酶，這些蛋白酶可以降解相關蛋白。如果蛋白樣品處理不當，蛋白質可能會發生非特異性蛋白質分解。細胞裂解或組織萃取過程中釋放的蛋白質可造成蛋白質破碎，產生分子量較低的較小片段。有些蛋白質比其他蛋白質更容易被降解。因此，細胞/組織裂解緩衝液的選擇、裂解條件以及蛋白酶抑制劑的使用都會影響結果。必須單獨或以即用型雞尾酒的形式加入阻斷各種蛋白酶活性的蛋白酶抑制劑，以減少或消除蛋白降解。
蛋白異構體
由單一基因編碼的許多蛋白質，由於在 mRNA 成熟過程中的另類剪接，存在多個序列變異或蛋白異構體。這可能會產生額外的蛋白質編碼序列和較高分子量的蛋白質產物，或由於過早的停止編碼子而產生較低分子量的蛋白質。此外，有些蛋白可能有多個轉譯起始位點，進而產生具有不同 N 端的異構體。蛋白質異構體會有不同的半衰期及亞細胞定位，並可能與不同的蛋白質子集互動或形成獨特的蛋白質複合物。
蛋白質前體
許多蛋白質在合成時會同時合成信號肽、前肽或兩者。信號肽和前肽隨後會被特定的蛋白酶裂解，生成成熟的蛋白質。
在凝膠電泳和 western 印迹中，有許多因素會導致觀察到的蛋白質分子量和計算出的蛋白質分子量之間出現差異。內在淨電荷、轉譯後修訂、聚集、降解、存在多種蛋白質變體以及前體加工等因素都可能造成偏移。了解這些因素有助於排除故障，並提供蛋白質結構和功能的進一步資訊。
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參考資料
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