| 問題 | 可能的原因 | 解決方案 |
|---|---|---|
| 溶液黏度高。 | 足夠的細胞破壞。 | 增加機械細胞破壞的效率，例如、增加聲納時間。(在聲波處理過程中，將樣本放在冰上，以避免起泡和過熱，因為這可能會使目標蛋白變性。過度聲波處理也可能導致宿主蛋白與目標蛋白共振）。在機械裂解前增加細胞糊的稀釋，或在裂解後稀釋以降低黏度。 |
| 離心或通過 0.22 或 0. | ||
| 顶层过滤器堵塞。 | 更換頂部篩選器。 | |
| 更換頂層過濾器。如果使用 MBPTrap 色譜柱，請更換色譜柱。 | Appendix 3 (Characteristics of Dextrin Sepharose High Performance products).離心和/或用 0.22 µm 或 0.45 µm 篩選器篩選樣品，或在載入下一個樣品之前以其他方式優化樣品前處理。 | |
| 在流過的樣品中發現蛋白質。 | 緩衝液/樣品組成並非最佳； 檢查樣品和結合緩衝液的 pH 值和組成。 | |
| 在生長培養基中加入葡萄糖以抑制淀粉酶的表達。 | ||
| MBP-tag is not present. | Use protease-deficient E. coli expression strains. | |
| 將MBP-tag與其他蛋白質末端融合。 | ||
| 由於蛋白濃度過高，蛋白在色譜柱中析出。 | Appendix 3 (Characteristics of Dextrin Sepharose High Performance products).在接下來的運行中，減少樣品量，或以線性梯度洗脫而非逐步洗脫的方式降低蛋白濃度。嘗試使用去垢劑或改變 NaCl 濃度。如果已使用 MBPTrap HP 1 ml 色譜柱，請更換為較大的 MBPTrap HP 5 ml。如果使用相同數量的樣品，這將降低最終濃度。如需快速擴展，可將一個色譜柱的末端擰入下一個色譜柱的頂部，串聯兩個或更多的色譜柱。 | |
| 污染物是标记蛋白的短形式 。 | 使用蛋白酶含量低的 大腸桿菌 表達菌株。細胞裂解後加入蛋白酶抑制劑。將 MBP-tag 與其他蛋白質末端融合。檢查是否存在內部翻譯起始點（對於 C 端 MBP-tag）或過早終止位點（對於 N 端 MBP-tag）。在樣品和緩衝液中使用 EDTA。 | |
| 污染物通過二價鍵與重組蛋白共價連接。 | 在細胞裂解和純化的所有緩衝液中加入還原劑。請注意，產量可能會降低。 | |
| 污染物與重組蛋白非共價連結。 | 增加細胞裂解和純化所有緩衝液的離子強度（高達 1 M NaCl），或加入溫和的去垢劑，0.1% Tween、0.1% CHAPS）。由於加入非離子洗滌劑可能會影響 MBP 與糊精的結合，因此請務必小心。 | |
| 未澄清的裂解液可能會在純化過程中增加氣泡形成。 | 在層析系統中安裝限流器可以防止這種情況發生。如果安裝了限流器，則必須更改壓力限制，以調整來自限流器的額外壓力。 | |
| 当色谱柱储存在 2°C至8°C 时，如果立即在室温下使用，由于空气溶解度降低，可能会产生气泡。 | 在使用前，讓色譜柱適應室溫幾分鐘。 |
材料
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