純化或去除絲氨酸蛋白酶，例如凝血酶和胰蛋白酶，以及酵母菌

樣品萃取程序通常會釋放蛋白質酶到溶液中，因此需要加入蛋白質酶抑制劑來防止不必要的蛋白水解。除了添加抑制劑之外，另一種方法是使用群組特異性抗性介質來移除樣品中的蛋白質酶。

合成抑制劑對氨基苄脒可用作胰蛋白酶、類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶和酶蛋白的抗原配體。苯甲脒 Sepharose 4 Fast Flow（高次）常用於去除細胞培養上清、細菌裂解液或血清中的分子。在製造重組蛋白質的過程中，通常會使用 GST 等標籤來促進純化和檢測。在重組蛋白中加入酵素特異性辨識位點，以便在需要時透過酵素裂解移除標籤。凝血酶常用於酵素裂解，通常必須從重組產品中移除。HiTrap^®苯甲脒FF（高子）為這一過程提供了簡單、即用的解決方案。 圖30顯示了苯甲脒Sepharose 4 Fast Flow（高子）的部分結構，表4列出了不同絲氨酸蛋白酶的例子。

圖 30. 苯甲脒 Sepharose 4 Fast Flow（高子）的部分結構。

表 4.不同絲氨酸蛋白酶的例子。

	來源	Mr	pl
Thrombin	Bovine pancreas	23 345	10.5
人血浆链 A 人血浆链 B<	5 700 31 000	7.1
人尿液	54 000	8.9
Enterokinase	豬腸重鏈 豬腸輕鏈	134 000 62 000	4.2
人血漿	90 000	6.4-8.5
Prekallikrein		6.人體血漿	nd	nd
Kallikrein	人類血漿 人類唾液	86 000 nd	nd (血漿) 4.0 (唾液)

淨化選項

	結合能力	最大操作流量	注意事項
HiTrap苄脒FF （高子）	預製色譜柱**<
苯甲脒色谱柱 4 快速流（高次）Trypsin, > 35 mg/mL medium	300 cm/h*	Supplied as a suspension ready for  column packing**
* 請參閱附錄 4，將線性流量 (cm/h) 轉換為體積流量。最大操作流量是根據床高 10 cm、內孔 5 cm 的填料柱測量計算得出。 ** 在 0.05 M 醋酸酸鹽、pH 4 含 20% 乙醇中供應。

純化示例

圖 31.顯示了一個使用低 pH 值洗脱法從人體血漿中去除胰蛋白酶樣蛋白酶以防止血漿成分蛋白水解的示例。活性測試證明，幾乎所有胰蛋白酶樣蛋白酶的活性都會從樣本中去除，並結合到色譜柱上。

圖 31. 使用 HiTrap^® Benzamidine FF (high sub)，1 mL，去除人體血漿中的胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶。

圖 32.顯示了使用 GSTrap FF 膠柱與 HiTrap^® 苄脒 FF (高次級) 純化 GST 融合蛋白的效果，然後透過凝血酶裂解位點裂解 GST 標籤，最後再移除凝血酶。當其他蛋白質沖過柱時，GST 融合蛋白會與 GSTrap FF 柱結合。

在 GSTrap FF 層析柱之後接上在結合緩衝液中預先平衡的 HiTrap^® Benzamidine FF (high sub) 層析柱，並在結合緩衝液中洗滌雙層析柱，然後再用高鹽緩衝液洗滌。裂解蛋白和凝血酶從 GSTrap FF 層析柱洗過，凝血酶與 HiTrap^® 苯甲脒 FF (high sub) 層析柱結合，洗出的餾分含有純淨的裂解蛋白。

圖 32. 使用 GSTrap FF 和 HiTrap^® Benzamidine FF（高次），在柱上裂解 GST 融合蛋白並去除柱上裂解後的凝血酶。

進行分離

結合緩衝液：0.05 M Tris-HCl、0.5 M NaCl、pH 7.4

洗脱緩衝液替代品：

- pH 洗脱：0.05 M glycine-HCl, pH 3.0 或 10 mM HCl, 0.05 M NaCl, pH 2.0

- 競爭洗脫：20 mM p-aminobenzamidine in binding buffer

- 變性洗脫：8 M 尿素或 6 M 鹽酸胍

1. 用 5 柱容量的結合緩衝液平衡色譜柱。
2. 用 5-10 柱容量的結合緩衝液清洗，或直到洗出液中無物質出現（在 A_{280 nm} 處監測 UV 吸收）。如果使用低 pH 值洗脱*，在中和缓冲液中收集馏分。純化後的餾分可使用脫鹽柱進行緩衝液交換（請參閱第 133 頁, 緩衝液交換與脫鹽）。

* 由於洗脫條件相當苛刻，請將餾分收集至中和緩衝液（60 µL - 200 µL 1 M Tris-HCl，pH 9.0 per mL fraction），使馏分的最终 pH 值近似中性。

由于联苯胺 Sepharose 4 Fast Flow（高子）具有一定的离子结合特性，建议使用 0.5 M NaCl，pH 值在 7.4-8.0 之间进行洗脱。如果使用較低的鹽濃度，請在上樣後、洗脫前加入高鹽洗滌步驟。

用於競爭洗脫的洗脫緩衝液在 280 nm 有較高的吸光度。洗出的蛋白必須用其他方法檢測，例如活性檢測、總蛋白或 SDS-PAGE 分析。

清洗

用 3-5 支柱体积的 0.1 M Tris-HCl、0.5 M NaCl、pH 8.5 溶液清洗，然后用 3-5 支柱体积的 0.1 M 醋酸鈉，0.5 M NaCl，pH 4.5，並立即用 3-5 柱容量的結合緩衝液重新平衡。

用非離子洗滌劑（如 0.1% Triton X-100）在 +37 °C 下清洗 1 分鐘，去除嚴重污染。

	配體密度	組成	pH穩定性*	平均粒徑
Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub)	12 µmoles p-aminobenzamidine/mL	配體經由14個原子間隔與高度交聯的4%瓊脂糖醯胺偶合	90 µM
*長期是指培養基長時間穩定而不會對後續色譜性能產生不良影響的 pH 區間。短期是指再生、原位清洗和消毒程序的 pH 值間隔。

化學穩定性

所有常用的水性緩衝液。

儲存

用20%乙醇在0.05M乙酸鈉，pH4.0中清洗培養基和色柱（對於包裝好的培養基，使用約5個色柱容量），並儲存於+4至+8 °C。

材料

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