純化或移除血清蛋白酶，例如凝血酶、胰蛋白酶和酵母菌

Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (low sub)、Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub)

樣品萃取程序通常會釋放蛋白質酶到溶液中，因此需要添加蛋白質酶抑制劑來防止不必要的蛋白水解。除了添加抑制劑之外，另一種方法是使用群組特定的 AC 媒介來移除樣品中的蛋白質酶。

合成抑制劑對氨基苄脒可用作胰蛋白酶、類胰蛋白酶絲氨酸蛋白酶和酶蛋白的抗原配體。苯甲脒 Sepharose 4 Fast Flow 常用於去除細胞培養上清、細菌裂解液或血清中的分子。在製造重組蛋白質的過程中，通常會使用 GST 等標籤來促進純化和檢測。在重組蛋白中加入酵素特異性辨識位點，以便在需要時透過酵素裂解移除標籤。凝血酶常用於酵素裂解，通常必須從重組產品中移除。HiTrap^® Benzamidine FF（高次）為此過程提供了簡單、即用的解決方案。21 显示了联苯胺 Sepharose 4 Fast Flow 的部分结构，并且 表 3.25 给出了不同丝氨酸蛋白酶的示例。Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow（高子）是專為高容量而設計的培養基。它的胰蛋白酶結合能力大於 35 mg/mL 的培養基。對於某些應用，Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub) 會誘發配體與目標分子間的強烈互動，可能導致純度與回收率降低。Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (low sub) 旨在平衡良好的容量與高純度和回收率。

圖 3.21. 苯甲脒 Sepharose 4 Fast Flow 的部分結構。

表 3.25. 不同絲氨酸蛋白酶的例子

	Source	Mr	I
Thrombin	牛胰腺	37 000	10。th>I
牛胰腺	37 000	10.5
胰蛋白酶	人類血漿鏈 A 人類血漿鏈 B	5 700 31 000	7。1
尿激酶	人尿>	54 000	8.9
Enterokinase	豬腸重鏈豬腸輕鏈	134 000 62 000	4.2
血漿蛋白原	人血漿	90 000	6.4-8.5
Prekallikrein	人血漿	nd	nd
Kallikrein	人血漿 人唾液	86 000 nd	nd（血漿） 4.0 (唾液)

層析介質特性

苯甲脒 Sepharose 層析介質的特性如表 3.26.

所示。

表 3.26. 苯甲脒 Sepharose 4 快速流（低次）和（高次）層析介質的特性

	配體密度 (µmol/mL)	成分	pH穩定性1	平均粒徑(µm)
Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub)	≥ 12	Amide coupling of p-aminobenzamidine ligand via a 14 atom spacer to Sepharose 4 Fast Flow (high sub)	短期：1 至 9 長期：2 to 8	90
Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (low sub)	6	對氨基苯甲脒配體經由 14 個原子間隔與 Sepharose 4 Fast Flow (high sub) 的酰胺偶合。	短期：1 至 9 長期：2 至 8	90

¹ 短期是指再生、原位清潔和消毒程序的pH間隔。

製備選項

Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow 低次級和高次級色譜介質和預包裝色谱柱的說明如表 3.27 所示。

表 3.27. 苯甲脒 Sepharose 4 Fast Flow 色層析介質和預封柱的純化選項

	結合能力	最大操作流量	備註
HiTrap Benzamidine FF (high sub)	胰蛋白酶, > 35 mg/column Trypsin, > 175 mg/column	4mL/min 20mL/min	預製：1mL column2。 預先包裝：5mL column2
Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (high sub)	胰蛋白酶, > 35 mg/mL medium	300厘米/小时1	以悬浮液形式提供，可用于柱包装2。
Benzamidine Sepharose 4 Fast Flow (low sub)	胰蛋白酶, 25 mg/mL medium	300厘米/小时1	以悬浮液形式提供，可用于柱包装2。

¹ See 附錄 4 將流速 (cm/h) 轉換為容積流速 (mL/min)。最大操作流速是在床高 10 cm、內孔距 5 cm 的填料柱中測量計算出來的。

² 在含 20% 乙醇的 50 mM 乙酸 pH 4.0 溶液中供應。

洗脱示例

图 3.23 显示了一个使用低 pH 值洗脱从人血浆中去除胰蛋白酶样蛋白酶以防止血浆成分蛋白水解的示例。活性測試證明，幾乎所有胰蛋白酶樣蛋白酶的活性都從樣品中去除，並結合到色譜柱上＜/p＞。

圖 3.22. 使用 HiTrap^® 苄脒 FF（高次）去除人血漿中的胰蛋白酶類絲氨酸蛋白酶，1 mL。

圖3.23顯示了使用GSTrap™ FF色譜柱與 HiTrap^® Benzamidine FF（高子）來純化GST標記蛋白的效果，然後通過凝血酶裂解位點裂解GST標記，最後再去除凝血酶。當其他蛋白質通過色谱柱時，GST-標記蛋白會與 GSTrap™ FF 色譜柱結合。

在 GSTrap FF 層析柱之後接上在結合緩衝液中預先平衡的 HiTrap^® Benzamidine FF (high sub) 層析柱，然後用結合緩衝液和高鹽分緩衝液洗滌兩層析柱。裂解蛋白和凝血酶從 GSTrap™ FF 層析柱洗過，凝血酶與 HiTrap^® Benzamidine FF (high sub) 層析柱結合，洗出的餾分含有純淨的裂解蛋白。

圖 3.23. 使用 GSTrap FF 和 HiTrap^® Benzamidine FF（高次），柱上裂解 GST 標記蛋白，並去除柱上裂解後的凝血酶。

進行分離

結合緩衝液：50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH 7.4

洗滌緩衝液替代品：

• pH洗滌：50 mM glycine-HCl，pH 3.0 或 10 mM HCl，50 mM NaCl，pH 2.0
• 競爭性洗脫：20 mM p-aminobenzamidine in binding buffer
• 變性洗脫：8 M 尿素或 6 M 鹽酸胍

1. 用 5 CV 結合緩衝液平衡色譜柱。
2. 用 5 到 10 CV 的結合緩衝液清洗，或直到洗出液中沒有物質出現為止（在 A_280 nm 進行 UV 吸收監測）。
3. 用 5 到 10 CV 的洗出緩衝液進行洗脫。如果使用低 pH 值洗脫¹，則在中和緩衝液中收集馏分。純化後的餾分可使用脫鹽柱進行緩衝液交換（請參閱緩衝液交換與脫鹽, 附錄 1）。

¹ 由於洗脫條件相當苛刻，收集馏分到中和緩衝液（60 至 200 µL 的 1 M Tris-HCl，pH 9.

由于苯甲脒 Sepharose 4 Fast Flow 具有一定的离子结合特性，建议使用 500 mM NaCl，pH 值在 7.4 和 8.0 之间的洗脱液。如果使用較低的鹽濃度，請在上樣後、洗脫前加入高鹽洗滌步驟。

用於競爭性洗脫的洗脫緩衝液在 280 nm 有較高的吸光度。洗出的蛋白必須用其他方法檢測，例如活性檢測、總蛋白或 SDS-PAGE 分析。

清洗

用 3 至 5 CV 的 100 mM Tris-HCl、500 mM NaCl、pH 8.5 清洗，然後用 3 至 5 CV 的 100 mM 醋酸钠、500 mM NaCl、pH 4.5 清洗，並立即用 3 至 5 CV 的結合緩衝液重新平衡。用非離子洗滌劑（如 0.1% Tween 20）在 37 °C 下清洗 1 分鐘，以去除嚴重污染。

化學穩定性

所有常用的水性緩衝液。

儲存

用20%乙醇在pH 4.0的50 mM乙酸鈉中清洗層析介質和色譜柱（填料介質使用約5 CV），並儲存於4 °C至8 °C。

材料

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