組氨酸標記蛋白的純化優化

本章將討論優化組氨酸標記蛋白的純化以達到高純度的三種方法：

• 使用不同的金屬離子進行優化<
• 使用多步純化進行優化

對於一般純化有關組氨酸標記蛋白質的一般純化，包括典型的工作流程、可用的層析介質和產品格式的描述、程序和故障排除提示，請參閱 第 3 章。

使用咪唑進行優化

表面暴露的組氨酸殘基或其他形成複合物的氨基酸的存在可能會導致未標記的宿主細胞蛋白與純化介質產生不必要的結合。這些未標記的蛋白可能會與目標蛋白一起洗脫。

下面的示例显示了结合过程中咪唑浓度的变化如何影响组氨酸标记的目标蛋白的纯度。

使用 Ni Sepharose^® excel 和 TALON^® Superflow 产品时，通常不建议在结合过程中加入咪唑。

1.咪唑作为竞争剂

咪唑被用作组氨酸标记蛋白洗脱的竞争剂。此外，咪唑可以低濃度加入樣品和結合緩衝液中，以減少雜質蛋白的結合，從而提高最終純度。

在樣品和結合緩衝液中加入 45 mM 的咪唑，純化來自牛分枝桿菌 (Mycobacterium bovis) 的組胞苷標記蛋白激酶 G [(His)₆-PknG]。實驗中使用的培養基為 Ni Sepharose^® 高性能（第 3 章，Purification using Ni Sepharose^® High Performance）。

為了獲得更高的蛋白質濃度，蛋白質以階梯梯度洗脫（圖 4.1A）。為了證明咪唑在結合過程中的優勢作用，我們在相同條件下進行了額外的純化，只是省略了咪唑（圖 4.1B）。需要注意的是，一般不建議在 Ni Sepharose^® High Performance 或 Ni Sepharose^® 6 Fast Flow 中省略咪唑；提供這個例子只是為了說明省略咪唑對洗脫目標蛋白純度的負面影響。

集合洗脱馏分的SDS-PAGE表明，当在样品和结合缓冲液中加入45 mM咪唑时，目标蛋白的纯度有很大提高（图4.1C）。在這種情況下，有45 mM咪唑存在的樣品中，目標蛋白的產率保持不變。請注意，咪唑的最佳濃度取決於蛋白質，因此必須依個別情況而定。

Figure 4.1. Purification of (His)6-PknG without (A) and with (B) 45 mM imidazole in the sample and binding buffer.使用ÄKTApurifier 色譜系統 (現由 ÄKTA pure 取代)，將 2 l 大腸桿菌培養物的裂解液 (樣品容量 26 mL；經由 0.45 µm 注射器過濾) 裝載於 2 mL Ni Sepharose® 高效能色譜柱 (XK 16/20 色譜柱) 上。激酶以 50% 和 100% 的洗脱缓冲液分两步梯度洗脱。(C) (His)6-PknG 分離物的 SDS-PAGE (12% 凝膠)，顯示結合緩衝液中沒有 (-) 和有 (+) 45 mM 咪唑的洗提物。資料由德國 Martinsried GPC Biotech AG 的 K. Hölscher、M. Richter-Roth 及 B. Felden de Neuman 慷慨提供。

2.使用 His SpinTrap 確定最佳咪唑濃度

結合和清洗過程中的咪唑濃度是目標蛋白質最終純度和產率的重要因素。他的 SpinTrap 是一種方便快捷的工具，可用於確定最佳咪唑濃度。最佳化對目標蛋白質的純度和產率都很重要。一系列的實驗證明了這一點：在樣本和結合緩衝液中使用 5、50、100 或 200 mM 的咪唑，在 His SpinTrap 上純化組氨酸標記蛋白 APB7-(His)₆ (M_r 28 000)。

5mM的咪唑浓度导致洗脱样品的纯度较低（图4.2，泳道3），而增加到50mM的咪唑可以防止大多数杂质的结合并提高纯度（图4.2，泳道4）。在樣品和結合緩衝液中加入 100 mM 的咪唑會降低產率，而純度則略有提高（圖 4.2，第 5 行）。收率降低的原因可能是在結合和洗滌過程中，高濃度咪唑的競爭作用導致目標蛋白結合較少。

這個例子顯示，在結合過程中，較高的咪唑濃度可以提高純度，而太高的濃度則會降低產率。結合過程中的最佳咪唑濃度取決於蛋白質。對於許多蛋白質來說，20 到 40 mM 的咪唑是 His SpinTrap 的最佳選擇。

圖 4.2. 組氨酸標記 APB7 蛋白在還原條件下進行 SDS-PAGE (ExcelGel SDS Gradient 8-18)。結合過程中的咪唑濃度會影響最終的純度和產率（比較第 3、4、5 和 6 行）。

使用不同的金屬離子進行優化

蛋白質與金屬離子之間的結合強度受幾個因素影響，包括目標蛋白質的結構和特性、蛋白質抗原標籤的存在和特性、金屬離子的特性以及結合緩衝液的 pH 值和組成。因此，Ni²⁺（被認為對組氨酸標記蛋白質具有最強親和力的金屬離子）不一定是特定應用的最佳選擇。因此，在某些情況下，其他過渡金屬離子可能更適合，例如 Co²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺ 和 Zn²⁺。

一般而言，我們建議使用預充有 Ni²⁺ 離子的 Ni Sepharose^® High Performance 或 Ni Sepharose^® 6 Fast Flow 色層析媒體，以獲得高容量。如果需要提高選擇性和純度，預先添加 Co²⁺ 的 TALON^® Superflow 是很好的選擇。若要改變選擇性，可使用未充電的 IMAC Sepharose^® High Performance 或 IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow 測試其他金屬離子。

以下指南可能有助於設計初步實驗，以確定最適合特定分離的金屬離子：

• Ni²⁺一般用於組氨酸標記的重組蛋白。

• Co²⁺也用於組組氨酸標記蛋白質的純化，因為它可能允許較弱的結合，並減少可能結合的雜質量。

• Cu²⁺和 Zn²⁺常用於未標記蛋白質的純化。Cu²⁺ 對各種蛋白質的結合力相對較強；有些蛋白質只會與 Cu²⁺ 結合。Zn²⁺ 離子的結合力通常較弱，此特性常被利用來達成目標蛋白質的選擇性洗脫。Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 都可用於組組氨酸標記蛋白質和製程級分離。使用 Fe³⁺ 時要格外小心，因為它在中性溶液中很容易還原。Fe³⁺ 常用於磷酸肽的純化，因為磷酸基對 Fe³⁺ 有強烈的親和力。固定化 Fe³⁺ 的層析應在 pH 值為 3 時進行，以消除來自羧基的非特異性相互作用。我們也建議在每次運轉後剝離固定化的 Fe³⁺ 離子，並視需要重新填充色譜柱。強綁定的 Fe³⁺ 離子和鐵化合物可在 50 mM EDTA 中過夜去除。

下面我們舉出兩個例子，說明選擇最適合的金屬離子和實驗條件（包括咪唑濃度）如何影響特定目標蛋白的純化。²⁺, Zn²⁺, and Ni²⁺ on HiTrap IMAC FFusing Cu 的比較研究。

在本研究中，APB7是一個(組氨酸)₆標記的蛋白質(M_r 28 000)，在E.大腸桿菌 BL-21 中表達的蛋白質 (Mr 28 000)。6 Fast Flow），並分別加入 Cu²⁺、Zn²⁺ 和 Ni²⁺。

進行了篩選實驗，以確定每種離子的最佳咪唑濃度[圖 4.3 (A至C)]。這三種純化的結果都顯示：

• 在 20 mM 的咪唑濃度時，在 Cu²⁺ 和 Zn²⁺ 的洗滌中，目標蛋白有顯著的滲漏（圖 4.3 中的箭頭）。3 A），表明咪唑濃度太高，無法達到最大產率。Ni²⁺的滲漏非常少。

• 在 10 mM 的咪唑中，Cu²⁺ 和 Zn²⁺在洗滌過程中目標蛋白質的滲漏明顯減少。在使用這三種金屬離子時，洗出池中目標蛋白的純度相似，但不如使用 20 mM imidazole 時純。Ni²⁺提供了最純的蛋白質，儘管其純度仍不及 20 mM 的咪唑。

請注意，在 SDS 聚丙烯酰胺凝膠中使用了大量的樣品。

結果說明，對於任何給定的金屬離子，咪唑濃度都可以調整，以達到高產率、高純度或成功的折衷。IMAC Sepharose^®介質通常需要在洗滌緩衝液中使用比市場上類似的 IMAC 介質稍高濃度的咪唑。使用 IMAC Sepharose^® 6 Fast Flow 或 IMAC Sepharose^® High Performance，在结合和洗涤缓冲液中加入 20 至 40 mM 的咪唑，是大多数分离的良好起点。請務必使用高純度的咪唑，它在 280 nm 下基本上沒有吸光度。要從蛋白質中去除咪唑，請使用脫鹽柱（第 11 章，脫鹽/緩衝液交換和濃縮）。

圖 4.3. 使用 IMAC Sepharose® 6 Fast Flow 純化 APB7 的餾分的 SDS-PAGE 分析 (還原條件)，預先包裝在 HiTrap IMAC FF 1 mL 色譜柱中，充入 Cu2+、Zn2+ 或 Ni2+，以及 (A) 樣品中含有 20 mM 的咪唑，(B) 樣品中含有 10 mM 的咪唑，或 (C) 樣品中含有 5 mM 的咪唑。凝膠以 Coomassie

2.使用銅對 HiTrap IMAC HPf 純度的優化 o²⁺、Zn²⁺、Co²⁺ 和 Ni²⁺

。

成功的純化需要注意目標蛋白質的特性以及目標蛋白質對所用金屬離子的適應性。四種不同的 HiTrap IMAC HP 1 m 膠柱預先包裝了 IMAC Sepharose^® 高效能膠柱，分別充入四種不同的金屬離子：Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺ 和 Ni²⁺。

結果證明了篩選樣本以決定最適合特定目標蛋白的金屬離子和純化條件的重要性。對於APB7，使用Ni²⁺或Co²⁺能獲得最高的純度，但與使用Zn²⁺和Cu²⁺的結果相比，差異很小（圖4.4）。這些範例中使用的咪唑梯度洗脫也提供了一種方法，可針對特定的純化選擇適當的咪唑濃度。

圖 4.4. 在大腸桿菌 BL-21 中表達的 APB7（組氨酸）6 標記蛋白質）在四種不同的 HiTrap IMAC HP 1 mL 色譜柱上分別用金屬離子充電後進行純化。(A) Cu2+、(B) Zn2+、(C) Co2+ 或 (D) Ni2+。標示出個別 1 mL 分離物 (未顯示) 經 SDS-PAGE 分析後所選出的集合。(E) SDS-PAGE 分析：還原條件，ExcelGel SDS Gradient 8-18；Coomassie 染色。

使用多步純化進行優化

目標蛋白可透過增加一個或多個額外的純化步驟進一步純化，如以下範例所示。第 9 章將詳細討論此主題 ()中的親和層析。

以下我們舉出兩個例子，展示目標蛋白的多步純化成功案例。

1.使用 AC 和 SECa 高分子量（組氨酸）分兩步純化 ₁₀-標記蛋白

2.在兩步純化(His)₁₀-trx-p450 (N-端組氨酸標記，10個組氨酸殘基)的過程中，在E.大腸桿菌製造，第一步使用 HisTrap FF 色譜柱。

在第一個純化步驟之後，偵測到三個主要的帶子（圖 4.5B，第 5 層）。第 6 行（來自 SEC 的池 2）包含全長目標蛋白。第 7 和第 8 試劑池 (分別為第 3 和第 4 試劑池) 含有截短形式的目標蛋白，經 N 端測序證實 (資料未顯示)。來自 SEC 的第 9 行（池 1）含有聚集蛋白。因此，隨後的 SEC 可以很好地分離截短形式和全長的目標蛋白質 (His)₁₀-trx-p450。

圖 4.5. (A)使用 AC 及 SEC 分兩步純化高分子量（組氨酸）10-標記蛋白。(B) 還原條件下的 SDS-PAGE 和 Coomassie 染色。

2.在ÄKTAxpress上對未clarified細胞裂解液進行自動三步純化

使用自動三步方案從100 mL未clarified E.coli 細胞裂解液中純化組氨酸標記的麥芽糖結合蛋白。coli 細胞裂解物中純化組氨酸標記的麥芽糖結合蛋白。這三個步驟是使用 HisTrap FF 粗（1 mL 柱）進行定性層析 (AC)，使用 HiPrep 26/10 進行脫鹽 (DS)，使用 Mono Q™ 5/50 GL 進行離子交換層析 (IEX)。這些在圖片中稱為 AC-DS-IEX。從 SDS-PAGE 分析可以看出，目標蛋白的純度很高，產率也很好。

圖 4.6. (A) AC-DS-IEX，IEX 峰放大，右側為收集池。產量：池 1 + 2 中為 9.4 毫克。 (B) IEX 洗出池的 SDS-PAGE。凝膠以 Coomassie 染色。