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首頁蛋白質純化使用 Ni Sepharose® 高效能純化組氨酸標記重組蛋白質

使用 Ni Sepharose® 高效能純化組氨酸標記重組蛋白質

Ni Sepharose High Performance 由高度交聯的 6% 瓊脂糖珠 (34 µM)組成，珠上固定了螯合基團，之後再充入 Ni2+ 離子。該層析介質對組氨酸標記蛋白具有非常高的結合能力，且 Ni2+ 離子的滲漏可忽略不计。

Ni Sepharose High Performance 可與所有常用的水性緩衝液、還原劑和變性劑（如 6 M Gua-HCl 和 8 M 尿素）以及一系列其他添加劑相容，並允許進行徹底的介質清洗程序（Ni Sepharose、Ni Sepharose excel、TALON Superflow 及不帶電的 IMAC Sepharose 產品的特性）。它在寬廣的 pH 值範圍內都很穩定。

Ni Sepharose High Performance 的主要特性是良好的流动性和高分辨率，是高性能纯化的选择。

Ni Sepharose High Performance 可在 20% 乙醇中预溶解，包装规格为 25 和 100 mL，以及本章稍后描述的方便的预包装形式。

Ni 高性能 Sepharose

圖 1.Ni Sepharose High Performance 預充 Ni2+，用於組氨酸標記蛋白的高效能純化。

Column packing

請參閱 Column packing and preparation ，以瞭解柱包裝的一般指南。

樣品製備

本樣品製備程序適用於所有包含 Ni Sepharose High Performance（細胞裂解）。

從濃縮儲備液中加入緩衝液、NaCl、咪唑和添加劑；用結合緩衝液稀釋樣本；或進行緩衝液交換，將樣本調整至結合緩衝液的成分和 pH 值。為了防止宿主細胞蛋白與暴露的組氨酸結合，必須在樣品和結合緩衝液中加入低濃度的咪唑（優化組氨酸標記蛋白的純化）。

在使用樣品前，立即將樣品通過 0.22 µM 或 0.45 µM 過濾器和/或離心。使用 His MultiTrap HP 時不需要過濾。如果樣本過於黏稠，可用結合緩衝液稀釋以防止堵塞；增加裂解處理（聲明、均質化）；或加入 DNase/RNase 以減少核酸片段的大小。

緩衝液準備

結合緩衝液：20 mM 磷酸鈉、0.最佳咪唑濃度取決於蛋白質；20 至 40 mM 適合許多蛋白質。)

洗脱缓冲液：20 mM 磷酸钠，0.5 M NaCl，500 mM 咪唑，pH 7.4。

用于缓冲液制备的水和化学品应具有高纯度。使用緩衝液前，請先用 0.45 µM 的過濾器過濾。

使用高純度的咪唑，因為這樣在 280 nm 處的吸光度會很低或沒有吸光度。

為了獲得最佳純度和產率，樣品和緩衝液中所需的最佳咪唑濃度因蛋白質而異。在結合緩衝液中，20 到 40 mM 的咪唑適用於許多蛋白質；在洗脫緩衝液中，500 mM 的咪唑可確保完全洗脫目標蛋白質。

作為咪唑洗脫的替代方法，可將 pH 值降低到約 4.5。(

洗脱

  1. 如果色谱柱含有 20% 的乙醇，用 5 柱体积的蒸馏水清洗。流速為 50 至 100 cm/h。有關流速計算，請參閱 Converting from flow velocity to volumetric flow rates 。
  2. 在流速為 150 cm/h 的條件下，使用 5 至 10 柱容量的結合緩衝液平衡色譜柱。
  3. 用結合緩衝液洗滌，直到吸光度達到基線。
  4. 用洗滌緩衝液進行梯度或線性梯度洗滌。
  5. 對於線性梯度洗脫，超過 20 柱容量的淺梯度可以分離具有相似結合力的蛋白質。
  • 洗脫後，用 5 到 10 柱容量的結合緩衝液清洗色譜柱，使其再生。

    • 如果要純化相同的蛋白質，每次純化之間不需要剝離和充電柱。任何純化柱的重複使用都取決於樣品的性質，而且只能使用相同的蛋白質，以防止交叉污染。有關此主題以及清洗和儲存的詳細資訊，請參閱 Ni Sepharose、Ni Sepharose excel、TALON Superflow 和不帶電的 IMAC Sepharose 產品的特性。

    手動測量吸光度時，使用洗滌緩衝液作為空白。如果需要去除蛋白中的咪唑，請使用脫鹽柱（Desalting/buffer exchange and concentration）。低品質的咪唑會在 280 nm 處產生明顯的背景吸光度。

    Ni Sepharose High Performance 可與還原劑相容。然而，我們建議在使用包含還原劑的緩衝液/樣品前，先去除任何弱結合的 Ni2+ 離子。要做到這一點，可以進行一次不含還原劑的空白試運行（見下文）。

    Ni Sepharose High Performance 中 Ni2+ 的泄漏在所有正常条件下都很低。對於非常關鍵的應用，在上樣前進行空白處理（如下所述），可進一步減少純化過程中的滲漏。

    空白運行：

    1. 使用結合緩衝液和洗脫緩衝液 不含還原劑。
    2. 用5個柱容量的蒸餾水洗滌色谱柱（以除去20%乙醇）。
    3. 用5個柱容量的洗滌緩衝液洗滌。
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