引言
隨著研究、診斷和治療領域對抗原特異性免疫球蛋白需求的增加，對抗體和基於抗體的試劑的高重現性和批與批間一致性的需求也在增加。
相較於使用琼脂糖的傳統純化方法，無論是以批次模式或包裝在旋轉柱中，都需要繁瑣的離心步驟，自動化磁珠處理器則能夠一次一致地處理多個樣品，同時減少操作時間。
液體處理機器人和磁珠處理機器人是常用於自動化磁珠分離方案的兩種系統。在液體處理機器人中，磁珠分離是透過整合外部 96 孔微量滴定磁架來實現的，以將磁珠從液體中分離出來。另外，磁珠處理機器人，如 KingFisher® 粒子處理器，則使用覆蓋一次性塑料吸頭的磁棒將磁珠從一種溶液移到下一種溶液。
G 磁珠提供了從複雜混合物（如血清、血漿或細胞培養上清樣本）中純化免疫球蛋白的快速且可重複的方法。在純化 IgG 時，樣品會與 PureProteome™ Protein G 磁珠混合一段短時間，以結合免疫球蛋白。然後利用磁性分離將珠子分離出來，再經過幾個洗滌步驟去除未結合的蛋白質。最後，結合的蛋白質會以高純度洗脫出來，供進一步的下游應用。在此，我們評估了 PureProteome™ Protein G Magnetic Beads 在使用 KingFisher® Duo 粒子處理器的全自動純化過程中，用於純化 IgG 的有效性。為了獲得最佳效果，我們對混合速度、磁珠收集時間、結合和洗滌步驟的持續時間等參數進行了優化，以便與PureProteome™蛋白質 G 磁珠一起使用。
材料與方法
抗體純化──標準手冊方案
使用 100 μL 懸浮的 PureProteome™ Protein G Magnetic Bead 泥漿（Cat.LSKMAGG10）在 1.5 mL 微離心管中進行（6 次重複）。使用含有 0.01% Tween® 20 洗滌劑 (Cat. No. 655205) 的磷酸盐缓冲液 (PBS) 作為結合/清洗緩衝液。使用 PureProteome™ Magnetic Stand (Cat. No. LSKMAGS08)，以 500 μL 結合緩衝液強力渦旋 10 秒，收集磁鐵上的珠子，並用移液管移除緩衝液，以清洗珠子。用結合緩衝液將兔血清（25 μL）稀釋至 200 μL，並加入珠子中。混合物在室溫下孵育 30 分鐘，並持續端對端攪拌。丟棄未結合的部分，如上所述，使用PureProteome™ Magnetic Stand擷取珠子，以 500 μL 洗滌緩衝液洗滌珠子三次。最後，向珠上加入 100 μL 0.2 M glycine HCl, pH 2.5，在室溫下混和 1-2 分鐘，進行 IgG 的洗脫。以類似方式再以 50 μL 進行一次洗脫，以達到最高產率。使用PureProteome™磁架將兩次洗提液收集到同一個微離心管中，並保存以備進一步分析。
Antibody Purification─KingFisher® Duo Protocol
首先，將所有試劑和樣品移入 KingFisher®® Duo系统（赛默飞世尔）上根据表1中列出的板面布局和优化条件（PureProteome™磁珠的混合和收集参数）设置了一个方案。與手動方案相似，使用 KingFisher® Duo 系統，將 100 μL 懸浮的 PureProteome™ Protein G 磁珠漿液用於純化 IgG。使用含有 0.01% Tween® 20 去垢劑的 PBS 作為結合/清洗緩衝液，將 25 μL 兔血清稀釋在總容量為 200 μL 的結合緩衝液中，用移液管移入微孔深孔 96 板的 D 行，使用中等混勻速度進行結合步驟 30 分鐘。用 0.2 M glycine HCl, pH 2.5 在洗滌條中進行洗滌，以獲得更好的樣品回收率。執行程序後，將板載入 KingFisher® Duo 系統。運行完成後，移除平板，收集純化的樣品作進一步分析。
利用 Bradford 分析法進行蛋白質定量
將 10 μL 的 IgG 標準品及樣品加入微孔板中，再加入 300 μL 的 Coomassie™ 試劑。在平板振動器上簡短混和反應，在 595 nm 波長下檢測樣品吸光度進行分析，並使用 IgG 標準曲線測定濃度。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）
純化的樣品（10 μL 洗離餾分）和對照兔血清（5 μL 的起始物）在 70 °C 下還原和變性 10 分鐘，並載入 1 mm 厚的 4-12% 梯度 NuPAGE® Bis-Tris 凝膠 (Life Technologies)。蛋白質在 200 V 下分離 35 分鐘。電泳結束後，將膠片從盒中取出，用Milli-Q®水簡單地沖洗和沖洗3次，然後用SimplyBlue™ SafeStain進行微波染色。染色後的凝膠再用 Milli-Q® 水洗 10 分鐘，然後成像。
結果
蛋白產率
用自動和手動方案獲得的純化樣品用 Bradford 分析法確定蛋白產率。結果顯示，使用KingFisher®系統洗脫的IgG總量與手動處理相似（表2）。
SDS-PAGE和Coomassie®染色
洗脱的馏分也用SDS-PAGE分析洗脱的特异性和重现性。染色凝膠（圖1）的目視檢查顯示出相近的純度和產率，表明PureProteome™蛋白質G磁珠可用於使用KingFisher®粒子處理器產生可重複的IgG批次。
圖 1.SDS-PAGE 凝膠：使用 PureProteome™ Protein G Magnetic Beads 從兔血清中純化 IgG。使用 0.2 M glycine HCl pH 2.5 進行抗體洗脫。樣品經由 SDS-PAGE 分離，並以 Coomassie® 染色顯現條帶（最左一條泳道顯示分子量標準；SM=起始材料；其餘泳道為 KingFisher® Duo 洗出的餾分及人工測試洗出的餾分）。
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