固相合成

在 PEG 聚苯乙烯支持樹脂上使用固相 FMOC 或 BOC 化學方法製造多肽。合成完成後，移除側鏈保護基團，同時從樹脂上裂解多肽。

肽的質量控制採用 ESI 質譜分析法（確認全長度產品）和反相 HPLC (RP-HPLC; 決定肽的純度)。不符合所需純度規格的多肽會經由 RP-HPLC 純化。

圖 1. 固相 FMOC

批次與批次之間的差異性

1. 多肽純度 - 多肽純度是指相對於所有其他雜質（水分除外）的所需多肽產品的量，由分析 HPLC 確定。多肽純度是最常見的變異，可能導致批次與批次之間的高度變異。與純度較低的同類產品相比，純度較高的多肽應顯示較少的變異性。純度較低的多肽在每個合成批次中可能含有不同數量的雜質。在某些情況下，具有一個或少數氨基酸缺失的多肽雜質仍具有活性，並有助於提高多肽的整體活性。
   
   
2. 聚集 - 疏水性多肽具有高度的聚集傾向。多肽的活性在很大程度上取決於哪些聚集形式仍然具有活性。
   
   
3. 化學轉換 - 多肽在儲存過程中可能會發生一系列化學轉換，導致失去活性。常見的例子包括含有 Asp-Gly 的縮氨酸會形成異-Asp、含有 Cys 的縮氨酸會透過形成二硫鍵而交聯，以及 Met 會氧化成硫醚和形成焦谷氨酸。如果多肽用於細胞培養研究，在大多數細胞中，Dithiotreitol (DTT) 的濃度小於 1 uM 時可以耐受。經由一般沉澱程序處理的低純度多肽，其大部分的 DTT 應已從最終的多肽材料中去除。一般而言，凍乾的多肽比溶液中的多肽更穩定。在-20 ^oC或-80 ^oC下保存凍乾的多肽可將降解降至最低。如果可能，應盡量減少暴露於 pH>8 和大氣中的氧氣。以下是肽的潛在降解途徑：
   1. 水解： 一般來說，含有 Asp (D) 的肽會有問題。避免含有 Asp-Pro (D-P) 或 Asp-Gly (D-G) 組合的序列，因為這些序列可能會脫水，產生環狀亞酰胺中間體。
      
      
   2. 氧化： Cys (C) 和 Met (M) 殘基是發生可逆氧化的主要氨基酸。半胱氨酸的氧化作用會在較高的 pH 值下加速，因為在較高的 pH 值下，硫醇更容易被去離子化，並容易形成鏈內或鏈間的二硫鍵。二硫鍵可以用去硫蘇力糖醇 (DTT) 或三（2-羧乙基膦）鹽酸 (TCEP) 處理來逆轉。蛋氨酸殘餘物會透過化學和光化學兩種途徑氧化，形成蛋氨酸亞硫醚和/或蛋氨酸砜，這兩種物質都很難逆轉。
      
      
   3. 二酮哌嗪和焦谷氨酸的形成： 二酮哌嗪的形成通常發生在甘氨酸 (G) 位於從 N 端開始的第三個位置時，如果 Pro (P) 或 Gly (G) 位於第一或第二位置，則會更常發生。該反應涉及 N 端氮對第二個和第三個氨基酸之間的酰胺羰基的親核攻擊，導致前 2 個氨基酸以二酮哌嗪的形式裂解。如果 Gln (Q) 位於序列的 N 端位置，焦谷氨酸的形成幾乎是不可避免的。N 端氮會攻擊 Gln (Q) 的側鏈羰基碳，形成脫氨基焦谷氨酸肽類似物。這種轉換也可能發生在 N 端位置含有 Asn (N) 的縮氨酸序列中，但程度較低。