ChIP 應用中的染色質碎片化

ChIP 應用中的染色質碎片化

片段化可確保高分子量染色質中的蛋白質/DNA複合物是可溶的，並可被您的ChIP抗體接觸到。您選擇的片段化方法取決於您進行的是 N-ChIP 還是 X-ChIP。如果您進行的是 N-ChIP，則應該使用適當的酵素（如微球核酸酶）來破碎 DNA，因為機械剪切方法會破壞原生組蛋白/DNA 的結合。如果您要進行 X-ChIP，您可以選擇機械音波或酵素消化來破碎 DNA。無論哪種情況，都必須優化剪切條件，並在每次實驗中使用完全相同的條件，以減少起始染色質可能出現的變異（圖 1）。

圖 1. 純化 DNA 片段的瓊脂糖凝膠電泳分析。純化的 DNA 片段經過了聲化 (Lane 2) 或不經聲化 (Lane 1)、蛋白酶消化、交聯反轉、萃取和沉澱。我們建議您在每次聲化實驗後，在瓊脂糖凝膠上分析 DNA。

染色素碎片處理技巧

• 在沒有優化的情況下，要複製已發表的剪切協議可能會很有挑戰性。如果您的儀器與這些方案中使用的儀器不同，情況可能尤其如此。有多種不同的聲納儀器，包括水浴式和探針式。使用探針式音波儀時，請根據您的樣品體積選擇適當的吸頭。
• 最佳化應包括功率設定（開啟時間相對於關閉時間/休息時間），以及獲得 200-1000 bp 長度 DNA 片段所需的剪切週期數。這個大小是很重要的，因為下游分析檢測的設計通常只能檢測到 100-200 bp 的擴增片段，其中包含一個感興趣的結合位點。要成功執行最佳化，每次最佳化實驗只改變一個參數；例如，在改變循環數的同時，保持功率設定不變。
• 聲化的效率也會因不同的細胞類型和細胞等量數而異。您可能需要針對不同類型的細胞或組織進行單獨的優化。
• 小心時間和功率設定。過度的聲波處理和過高的功率設定可能會破壞您嘗試保留用於免疫沉淀步驟的表位。這會降低您的 ChIP 信號。
• 請始終保持裂解液冰冷，並間隔而非持續地進行聲波處理，因為聲波處理會產生熱量，而熱量會使染色質變性。避免在聲納過程中產生泡沫。起泡會導致蛋白質表面變性，並造成染色質在氣泡中流失。
• 優化條件時，在每個聲納週期後，用瓊脂糖凝膠電泳分析 DNA 片段的長度。為了達到最佳尺寸，您應該在電泳前執行額外的清理步驟來純化 DNA。大而不溶的蛋白質因剪切不充分而產生的 DNA:RNA 復合物可能會堵塞瓊脂糖凝膠的孔隙，延遲電泳過程。純化 DNA 的方法是消化蛋白質、逆轉交聯、進行酚：氯仿萃取，並沉澱澄清的 DNA。

 

注意：異染色質可能會對聲波處理有抵抗力，這可能會降低染色質的產量。