KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒含有第一個DNA聚合酶，該聚合酶通過靶向進化進行了改造，能夠更好地耐受SYBR Green I染料的抑制。KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒的穩定性、處理能力和速度都得到了改進，因而具有持續的高擴增效率，能夠為基因表達分析提供更精確的相對定量。 KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒專為在嚴格的即時 PCR 反應 條件下實現最佳性能而設計，在信噪比 （螢光）、定量週期（Cq）、線性和靈敏度方面都有顯著的改進。
KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X) Kits 中的酶是什麼？
KAPA SYBR DNA 聚合酶是 Taq DNA 聚合酶的工程變體。它是通過定向進化過程專門為用於基於 SYBR Green 的 qPCR 而設計的。與野生型 Taq DNA 聚合酶相比，KAPA SYBR DNA 聚合酶受 SYBR Green I 染料的抑制較少，處理能力較強，因此靈敏度、螢光和速度都有所提高。這種酵素整合了抗體介導的熱啟動功能，因此在反應建立過程中保持不活躍，將非特異性產物的形成降至最低。
使用 KAPA SYBR® DNA Polymerase 進行以 SYBRGreen I 為基礎的 qPCR 有什麼好處？
- 降低了對SYBR Green I染料的抑制，因此在SYBR Green I濃度較高的情況下，PCR效率較高。野生型 Taq DNA 聚合酶在此專利緩衝液中無法運作。
- 與含有野生型 Taq DNA 聚合酶的試劑盒相比，由於工程酶的處理能力提高，因此整體運行時間更短。
我應該在 qPCR 反應中加入多少模板？
若要獲得最佳的定量結果，每 20 µL 反應中最多使用 20 ng 基因組 DNA 或質粒 DNA。對於兩步 RT-PCR，可使用未稀釋或由 1 µg 總 RNA 產生的稀釋 cDNA。cDNA （反轉轉錄產物）的容量不應超過 PCR 最終容量的 10%（例如，對於 20 µL 的 qPCR 反應，最多使用 2 µL 未稀釋的 cDNA）。
何時在 qPCR 反應中加入 ROX 被動參考染料？
對於某些實時 cycler，ROX 被動參考染料用於補償螢光檢測中與 PCR 無關的變化。在 qPCR 過程中，ROX 參考染料的螢光不會改變，但會提供一個穩定的基線，PCR 相關的螢光信號會根據這個基線進行規範化。因此，ROX 可以補償因反應量的微小變化或孔位置的不同而造成的孔間螢光檢測差異。所有 Applied Biosystems 儀器都必須使用 ROX（ROX High 或 ROX Low），Stratagene Mx 系列儀器則為選配。Bio-Rad/MJ Research、Cepheid、Corbett Research、Qiagen、Eppendorf 和 Roche 的儀器則不需要 ROX（但需要注意的是，Bio-Rad iCyclers 需要螢光素作為被動參比染料）。主混合物中含有 ROX 不會干擾任何儀器上的 qPCR，因為該染料不參與反應，而且其發射光譜與 SYBR Green I 不同。
我是否需要在 qPCR 反應中添加額外的氯化鎂？
KAPA SYBR qPCR Master Mix(2X)提供的MgCl2 最佳最終濃度為2.5 mM。額外的 MgCl2 不太可能提高反應效率或特異性。
為什麼抗體介導的熱啟動 DNA 聚合酶需要在 95 °C 下超過 10 秒的初始活化時間？
雖然抗體介導的熱啟動KAPA SYBR DNA聚合酶在95 °C下10秒後就被激活，但模板的最佳變性可能需要長達3分鐘。例如，人類基因組 DNA 或 GC 含量高的模板需要比質粒 DNA 更長的初始變性時間。
最短的合併延長/退火時間是多久？
在以 SYBR Green 為基礎的 qPCR 中，最大化擴增效率的最關鍵因素之一是最佳引物退火和延伸。最佳引物退火時間取決於引物的序列和長度。這意味著最短退火時間有可能從 20 秒縮短至 15 秒，但這必須根據經驗確定。由於 KAPA SYBR DNA 聚合酶具有極高的處理能力，如果使用三步法，300 bp 以下的擴增子延展時間為 1 秒即可。
為什麼我要使用三步驟循環方案，而不是兩步驟方案？
當引物的最佳引物退火溫度低於 60 ℃時，建議轉換為三步協議。例如，如果最佳退火溫度為 55ºC，則在 55 ℃ 下進行 20 秒退火，然後在 72 ℃ 下進行 1 秒延伸並擷取數據。
如何消除無模板對照 (NTC) 中引物二聚體的形成？
在 NTC 中引物二聚體形成的原因通常是由多種因素造成的。這些因素包括：引物退火溫度未達最佳（通常是由於不同 qPCR 套件的緩衝條件不同造成的）、引物合成未達最佳（HPLC 純化的引物形成的引物二聚體較少，適用於低拷貝數檢測），以及引物設計不佳（設計引物時建議使用 Primer3 等軟體）。另一種方法是，如果引物二聚體的擴增超出了實驗數據的範圍，則減少 qPCR 反應的總循環次數，例如：如果被測樣本的平均 Cq 為 28 個循環且只包含特異性產物（無引物二聚體），而 NTC 在 37 個循環後擴增出引物二聚體，則反應可運行 35 個循環而非 40 個。只有當被測樣本產生特定的產物，而不是特定產物和引物二聚體的組合，而且目標物不可能以低拷貝數出現時，才可以採用這種方法。
為什麼 KAPA SYBR® FAST qPCR 試劑盒並非在所有情況下都優於競爭對手？
KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒的性能之所以優於市場上的其他試劑盒，主要是由於其優越的加工性和KAPA SYBR DNA Polymerase比含有野生型Taq DNA Polymerase的試劑盒更穩健。在某些情況下，特別是對於容易擴增的靶點，KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒的性能會與競爭對手的試劑盒相近。一般而言，從複雜的靶點（如人類基因組 DNA）或擴增 AT 或 GC 含量高的模板時，會發現性能上最顯著的差異。值得注意的是，與其他試劑盒比較性能差的另一個原因是，沒有遵循 KAPA SYBR FAST qPCR 試劑盒的週期條件--使用為野生型 Taq DNA 聚合酶設計的週期條件（通常是化學介導的熱啟動條件）會嚴重影響我們的工程聚合酶的效率。
為什麼 KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix (2X) Kit 在 ROX 標準化後信號強度不如預期高？
在KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix中添加正确浓度和数量的参比染料对优化分析至关重要。如果添加到混合母液中的参比染料浓度或用量不正确，归一化信号可能低于预期（如果添加了过多的ROX），或高于预期（如果添加了过少的ROX）。使用前一定要解凍和混合溶液。請參閱相關的 KAPA SYBR FAST qPCR Kit 使用手冊，以確定加入 ROX 的正確數量和濃度。如果使用 ABI 儀器，也可以在關閉 ROX 過濾器的情況下分析原始信號。
KAPA SYBR® FAST qPCR 試劑盒的儲存建議是什麼？
KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix 在 4 °C 下穩定，但也可在 -20 °C 下保存。試劑盒對光線敏感，應避免直射，尤其是在儲存期間。還應注意避免凍融循環。在這些條件下儲存並正確處理時，試劑盒的全部活性可保留至少 12 個月，如試劑盒標籤所示。
如果我使用的是 ABI 7900 HT 儀器，在循環後，擴增視窗中沒有信號，但在瓊脂質凝膠上運行時有特定的產物，該怎麼辦？
確保KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix含有ROX High（如果使用通用試劑盒）。如果主混合物中沒有添加 ROX，或者添加了不正確的 ROX，請關閉 ROX 過濾器重新進行分析。
KAPA SYBR® FAST qPCR試劑盒可以搭配Roche® LightCycler® 2.0毛細管qPCR儀器使用嗎？
是的。 但是，Roche LightCycler 1.2、1.5和2.0毛細管儀器需要在qPCR反應中加入未乙酰化的BSA，最終濃度為250 ng/µL，以防止DNA聚合酶和模板與玻璃毛細管結合。
實現單一副本檢測的最佳方法是什麼？
高反應效率與最佳引物設計和引物純化結合，是實現單拷貝檢測的關鍵。使用退火溫度梯度可以優化反應效率。設計引物時應使用合適的 qPCR 引物設計程式（如 Primer3），並強烈建議使用 HPLC 純化引物，以減少 PCR 偽影的形成。
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？