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選擇正確的客製化 qPCR 探針

可用於 qPCR 的客製探針選擇眾多,每種探針在不同的應用中都有其優點。下面的摘要重點介紹了常用自訂 qPCR 探針的應用。

表 1.*鎖定核酸可加入 PCR 引物或 qPCR 探針中,以提高特異性。除美國以外,所有國家均可在 qPCR 探針以外的寡核苷酸中加入鎖定核酸。

報告器、淬火劑和儀器相容性

現代的 qPCR 平台通常具有多個檢測通道,因此可以靈活選擇探針標籤。重要的是,要選擇與 qPCR 儀器檢測通道相容的螢光標籤,並確保為儀器進行正確的過濾器設定或檢測校準。報告器和儀器相容性表列出了一些最廣泛使用的 qPCR 平台,並指出可使用的螢光標籤。請注意,並非所有標籤都已列出,而且還有許多替代報告器可供使用。有關在這些平台上使用非標準標籤的資訊,請聯絡您當地的專業技術服務人員。

染料替代品

幾種 qPCR 儀器使用一般無法在市場上買到的專有染料,例如 VIC® and NED™。在尋找染料替代品時,以下標準非常重要:

  • 激發和檢測波長與儀器光源和檢測系統相容
  • 對於探針,淬滅劑可有效吸收報告器發射波長的光
  • 消光係數越高,染料越亮,有助於靈敏檢測&?nbsp;
  • 使用多種染料(多重)時,每種染料的激發和發射波長必須獨立,以避免串擾

Quenchers

淬火分子通常放置在單分子探針的 3' 端,例如雙標記探針、分子信標和 Scorpions 探針。淬火劑可以是螢光分子 (TAMRA™) 或非螢光分子 (DABCYL、Black Hole Quencher™ (BHQ™))。為達到最佳效能,淬火劑的吸光光譜應儘可能與報告器的發射光譜相匹配。建議的報告器/淬火器組合可在光譜特性表中找到。

表 2.光譜特性表
表 3.報告器與儀器相容性表
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