細胞活力與增殖測試
簡介
引言
測量細胞增殖、細胞活力和細胞毒性的檢驗方法常用於監測培養物中的細胞在受到各種刺激處理後的反應和健康狀況。檢測方法的正確選擇取決於所用細胞的數量和類型以及預期結果。細胞增殖的檢測方法可監測長時間內的細胞數量、細胞分裂次數、新陳代謝活動或 DNA 合成。使用存活率染料（如胰藍或 Calcein-AM）進行的細胞計數可提供增殖率以及存活細胞的百分比。
圖 1.A, 使用 BrdU 染色法檢測 E4 小雞胚胎眼球中的增殖細胞 B, 使用喜樹堿檢測 Anti-BrdU 抗體。以細胞週期停滯劑喜樹堿處理 Jurkat 細胞，循環細胞會被困在 G1/S 期轉換。
EdU增殖試驗
Baseclick的EdU增殖試驗 提供了一種有效的方法來對複製的DNA進行螢光檢測。將修飾過的核苷 EdU 加入活細胞，並併入複製的 DNA 中。銅誘導點擊化學允許螢光探針快速附著到 EdU 上。這提供了一種定量監測增殖細胞的方法。該檢測方法有多種形式，適用於顯微成像、流式細胞計、高通量篩選，以及用於 活體 實驗。四種不同的螢光探針峰值激發分別為 488、555、594 和 647，可與其他螢光探針進行多重分析。
圖 2.Edu-Click 細胞增殖試劑盒在活躍的 DNA 合成過程中將 EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）加入 DNA 中，並使用點擊化學螢光檢測方法進行測量。
新陳代謝增殖測試
測量新陳代謝活動的測試適合分析增殖、存活率和細胞毒性。還原四唑鹽如 MTT、 XTT, and WST-1 to colored formazan compounds or the bioreduction of resazurin occurs only in metabolically active cells.活躍增殖的細胞會增加其代謝活性，而暴露於毒素的細胞則會降低活性。
MTT細胞增殖試驗
MTT （3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑；噻唑藍）是一種水溶性四唑鹽，在缺乏酚紅的培養基或鹽溶液中製備時會產生淡黃色溶液。溶解的 MTT 會透過脫氫酵素裂解四唑環，轉換成不溶性的紫色甲臢。這種不溶於水的甲臢可以用異丙醇或其他溶劑溶解，溶解的物質用分光光度法測量，吸光度是轉換染料濃度的函數。
XTT 細胞增殖試驗
與 MTT 相反， ；XTT 可溶解於水；因此不需要溶解步驟。四氮唑鹽 XTT 透過複雜的細胞機制裂解為甲臢。這種生物還原作用只發生在有活力的細胞中，並且與透過糖酵解產生的 NAD(P)H 有關。形成的甲臢染料量與培養物中代謝活躍的細胞數量直接相關。
WST-1 Cell Proliferation Assays
穩定的四唑鹽 WST-1 通過主要在細胞表面發生的複雜細胞機制裂解為可溶性的甲臢。這種生物還原主要取決於有活力細胞中 NAD(P)H 的糖酵解產量。形成的甲臢染料量與培養物中代謝活躍的細胞數量直接相關。
方案指南：WST-1 Assay用於細胞活力和增殖。方案、常見問題及疑難排解
。
圖 3.MTT 分析法是基於新陳代謝活動評估細胞增殖的比色法。NAD(P)H依賴的細胞氧化還原酵素可反映有活力細胞的數量。這些酵素能夠將黃色四唑染料 MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物還原為其不溶性的甲臢，甲臢呈紫色。
發光細胞活力分析
由於 ATP 是新陳代謝活躍細胞的指標，因此可根據可用的 ATP 量來評估有活力細胞的數量。該 ATP細胞活力螢光素酶分析 提供了一種高靈敏度的均質分析方法，用於量化細胞培養物中的ATP。本試劑盒利用萤火虫荧光素酶氧化 D-荧光素以及由此产生的光来评估细胞培养物中可用的 ATP 量。靈敏的檢測程序只需將 ATP 檢測雞尾酒直接添加到在血清補充的培養基中培養的細胞中。不需要清洗細胞、移除培養基或多次移液。本試劑盒的靈敏度足以檢測一個細胞或 0.01 皮摩爾的 ATP。產生的信號在六個數量級內是線性的。由於 ATP 的數量與存活細胞的數量相關聯，因此該檢測具有廣泛的應用，從存活細胞數量的測定到細胞增殖，再到細胞毒性。
圖 4.生物發光 ATP 螢光素酶細胞存活率檢測。萤火虫荧光素酶利用 ATP 氧化 D-Luciferin 并由此产生光，以评估与细胞数量和活力相关的 ATP 可用量。
螢光染料增殖分析
CFSE 標籤
5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE) is a popular choice for measuring the number of divisions undergone by a cellular population.進入細胞後，CFSE 會被細胞內的酯酶裂解，形成螢光化合物，琥珀酰亞胺酯基會與細胞內蛋白質上的伯胺發生共價反應。分裂時，每個子細胞的螢光強度會減半，因此可利用流式細胞儀簡易偵測細胞分裂的次數。CFSE 已被廣泛用於測量淋巴細胞（包括 T 細胞）的增殖。
活細胞/死細胞雙重染色
活細胞/死細胞雙重染色 可用於同時對活細胞和死細胞進行螢光檢測。 /TW/zhCalcein-AM 是一種高度親脂且具細胞膜穿透性的染料。雖然鈣化素-AM 本身不是螢光分子，但在有活力的細胞中，鈣化素-AM 經由酯酶生成的鈣化素會發出強烈的綠色螢光 (λex 490 nm, λem 515 nm)。因此，/TW/zhCalcein-AM 只能對存活的細胞染色。相比之下，核染色染料 碘化丙啶 無法穿透存活的細胞膜。它會通過死亡細胞膜的無序區域到達細胞核，並與 DNA 雙螺旋交疊而發出紅色螢光 (λex 535 nm, λem 617 nm)。由於 Calcein 和 PI-DNA 都能被 490 nm 的光激發，因此可使用單激發螢光顯微鏡同時監測存活和死亡的細胞。
圖 5.活/死細胞雙重染色
細胞活力成像套件< 是一種三色檢測，可用於 2D 和 3D 細胞培養物，可同時對存活細胞 (Calcein-AM)、死亡細胞 (Propidium Iodide/PI) 以及總細胞 (Hoechst 33342) 進行螢光染色。
- 鈣化素-AM 在結合鈣時發出綠色螢光，依靠只存在於新陳代謝活躍的活細胞中的酯酶活性。
- 碘化丙啶 (PI) 是一種核染料，會被活細胞的膜排斥，但會穿透死細胞受損的膜，與 DNA 互換而發出強烈的紅色螢光。
- Hoechst 33342 是一種具有低細胞毒性的 DNA 染色染料。它發出藍色螢光，可作為總細胞數的指標。
Trypan Blue Cell Counting
Trypan Blue is one of several stains recommended for use in dye exclusion procedures for viable cell counting.此方法的原理是活的（有活力）細胞不吸收藍色染料，而死的（無活力）細胞則吸收。細胞存活率可利用總活細胞/總細胞（活細胞與死細胞）之比來計算。染色也有助於觀察整體細胞形態。
注意：Trypan Blue 對血清蛋白的親和力大於細胞蛋白。如果由於基質中存在血清而導致背景太暗，則在計數前應先將細胞切碎，並在無蛋白質的培養基或鹽溶液中重懸。
注意：胰盤藍對血清蛋白的親和力比對細胞蛋白的親和力強。
參考資料
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