以細胞為基礎的細胞凋亡檢測方法
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡，是一種限制生長的調節機制，細胞可藉此因無法彌補的細胞或 DNA 損傷而對細胞外訊號作出反應，引發自身死亡。腫瘤細胞能夠躲避細胞凋亡是大多數癌症的特徵。凋亡在發育機制中也扮演重要的角色，例如防止發育中的大腦神經細胞系過度生長，以及調節四肢發育中的趾間距。 自動吞噬 和細胞凋亡是有關聯的，兩者之間會發生廣泛的串聯。例如，在營養不足時，自噬會發揮促生存機制的功能。然而，過度的自噬可能會導致細胞死亡，這個過程在形態上有別於細胞凋亡。細胞凋亡是一個多步驟的過程，包括早期、中期和後期的細胞事件，可以使用各種細胞檢測方法進行檢測，包括下文概述的Annexin V、Caspase和TUNEL檢測方法。
細胞凋亡的階段
Early-Stage Events：磷脂酰絲氨酸轉移到質膜外葉 (1)、線粒體膜電位喪失 (2)、細胞色素 C & ATP 釋放 (3) 及 caspase-8 和 9 啟動 (4)。
中期事件： 活化 caspase-3、6 和 7 (5)、Poly-ADP-Ribose 聚合酶 (PARP) 分裂 (6)、細胞縮小 (7) 和活化核酸酶 (8)。
晚期事件： DNA 碎裂 (9)、核崩解 (10)、形成凋亡體 (11) 以及巨噬細胞的吞噬 (12)。
早期凋亡
Annexin V 分析：磷脂酰丝氨酸通常被限制在有活力细胞的内膜小叶中。磷脂酰絲氨酸轉移到暴露的膜表面是細胞凋亡的早期事件，在此它是吞噬細胞攻擊的信號。Annexins 是結構上相關的蛋白質家族，可與細胞膜特異性結合。Annexin V 對含有負電荷磷脂質磷脂酰絲氨酸的膜有非常高的親和力，可作為早期細胞凋亡事件的標記。
圖 1.用不同濃度的凋亡誘導劑處理 Jurkat 細胞並用 Annexin Red Kit (FCCH100108) 染色的點陣圖。Jurkat 細胞未經處理（圖 A），或用 0.1 uM（圖 B）或 3 uM Staurosporine（圖 C）處理，然後用 FlowCelllect Annexin Red Kit 染色。
線粒體檢測: 線粒體是重要的細胞細胞器，可維持關鍵的細胞能量平衡，含有細胞死亡過程（如凋亡）的關鍵調節因子，並在細胞氧化壓力產生過程中扮演重要角色。線粒體膜電位的崩解被認為與線粒體外膜的滲透、Cytochrome C 和其他促凋亡蛋白質釋放到細胞體內同時發生，進而引發凋亡連鎖反應的下游事件。
中期凋亡
Caspase Detection Assays：細胞凋亡過程的一個核心成分是稱為 Caspases 的蛋白質分解酵素連鎖反應。Caspases 參與了一系列反應，這些反應是對促凋亡信號的觸發，並導致蛋白質底物的裂解，造成細胞的解體。 Caspase 酵素能特別辨識目標底物上的 4 或 5 個胺基酸序列，其中必然包括一個天冬氨酸殘基。該殘基是裂解的目標，裂解發生在天冬氨酸殘基的羰基末端。
使用 CellASIC® ONIX2 微流控系統進行免疫細胞凋亡的活細胞成像
圖 2.活細胞檢測 MCF-7 乳癌細胞的線粒體膜電位、caspase 活性和細胞凋亡。未處理的 MCF-7 細胞 (86012803) (A)，或以司陶錫林 (S5921) 處理過夜以誘發細胞凋亡 (B)，然後以 BioTracker™ 405 藍色線粒體染料 (SCT135)、BioTracker NucView® 530 紅色 Caspase-3 染料 (SCT105) 和 CF®488A Annexin V 染色，在 37°C 的細胞培養液中染色 30 分鐘，不需清洗。健康細胞顯示線粒體染色（青色），凋亡細胞失去藍色染色（青色），並顯示細胞核染色增加（紅色）和細胞膜的 CF®488A Annexin V 染色（綠色）。
晚期細胞凋亡
TUNEL 分析：細胞凋亡中的 DNA 破碎通常與細胞形態的結構改變有關，是晚期細胞凋亡的特徵。可使用 TUNEL 分析檢測細胞凋亡中的 DNA 片段。TUNEL試驗檢測到的DNA鏈斷裂的原位染色和隨後的光學顯微鏡可視化提供了關於DNA損傷和晚期細胞凋亡的具有生物意義的數據。
圖 3.ApopTag™ 系列的細胞凋亡試劑盒透過 TUNEL 分析檢測 DNA 片段。DNA 鏈斷裂是透過酵素標記游離的 3'-OH 末端與修飾的核苷酸來檢測的。DNA 断裂时产生的这些新的 DNA 末端通常定位在形态上可识别的细胞核和凋亡体中。
圖 4.A) 使用 ApopTag® 過氧化酶 (S7200) 檢測人類淋巴結中的凋亡細胞。組織以 10% 中性緩衝福爾馬林固定，石蠟包埋。B) 用 ApopTag® Fluorescein Direct 試劑盒 (S7160) 檢測小鼠胚胎前肢芽的凋亡細胞，組織經 10% 中性緩衝福爾馬林固定及石蠟包埋。C) 用 ApopTag® Red (S7165) 檢測人類淋巴結組織中的凋亡細胞，10% 中性緩衝福爾馬林固定，石蠟包埋。
H2A.X分析： 雙鏈DNA斷裂（DSB）的產生會迅速導致組蛋白變體H2A.X的磷酸化。由於H2A.X在Ser139的磷酸化與每個DSB有很好的關聯性，因此磷酸化-H2A.X是用來檢測DNA損傷和晚期細胞凋亡的敏感標記。
結論
程式化的細胞死亡（凋亡）是由多種訊號傳導和作用通路所控制，這些通路與線粒體去極化、Caspase 相關的凋亡酵素階級、DNA 破碎以及最終的細胞剝落和破壞有關。在許多疾病（如癌症）中，這些和其他連結的完整性可能會受到基因損害，因此在許多研究實驗中，偵測和測量細胞凋亡是非常有用的。我們已發表的細胞凋亡檢測方法，包括 ApopTag® 系列的 TUNEL 檢測方法和 CaspaTag™ 系列的原位 Caspase 檢測方法，可讓我們以可重複的方式深入了解細胞死亡機制。
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