使用血球計數器進行細胞計數

對於大部分使用 細胞株，例如轉染、細胞融合技術、冷凍保存及亞培養程序，在使用前必須量化細胞數量。使用一致的細胞數量可維持最佳生長，也有助於使用細胞培養物的標準化程序。如此一來，結果的再現性就會更好。

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• 實驗室。設備
• 重點

材料

• 细胞培养基：預先加熱至適當溫度（有關正確的培養基與溫度，請參閱 ECACC 細胞品系資料表。)
• 無菌水中的 70% (v/v) 酒精 (793213)
• 胰藍溶液（T8154）
• 0.05% Trypsin/EDTA in HBSS, without Ca²⁺/Mg²⁺ (T3924)>T3924）

設備

• 個人防護裝備（無菌手套、實驗室外套、安全面罩）
• 水浴槽設置到適當的溫度
• 微生物安全櫃處於適當的密閉等級
• 離心機
• CO₂培養箱
• 血細胞計
• 倒置相差顯微鏡
• 預先標記的瓶子

程序

1. 如前所述，使用胰蛋白酶/EDTA使粘附和半粘附细胞悬浮，并在至少相当于胰蛋白酶体积的新鲜培养基中重悬。
2. 在無菌條件下取出 100-200 μL 的細胞懸浮液。
3. 加入等量的胰藍 (Trypan Blue) (稀釋係數 =2)，用移液管輕輕移動混勻。用輕微的壓力將蓋玻片在腔體上來回滑動，直到出現牛頓折射環（牛頓折射環在蓋玻片下呈彩虹狀）。
4. 將細胞懸液（約 5-10 μL）填入小室兩側，在倒置相差顯微鏡下使用 x20 倍率觀察。理想情況下，應計算 100 個細胞，以提高細胞計數的準確性（請參閱下面的註釋）。
5. 使用以下公式計算存活和未存活細胞的濃度以及存活細胞的百分比。

圖 1. 計算有活力細胞數、無活力細胞數及每毫升細胞活力百分比的公式。

關鍵點

1. Trypan Blue 具有毒性，是一種潛在致癌物。應穿戴防護服、手套和臉部/眼睛保護設備。請勿吸入蒸氣。

2. 計數室的中央區域為 1 mm²。此區域再細分為 25 個較小的方塊 (1/25 mm²)。每個方格都有三重線圍繞，然後再細分為 16 個 (1/400 mm²)。室的深度為 0.1 mm。

3.修正係數 10⁴ 轉換 0.1 mm³ to 1 mL (0.1 mm³ = 1 mm² x 0.1 mm)

4.有幾個不準確的來源：

•  腔室中存在氣泡和碎屑
• 腔室過滿，以致樣品流入通道或另一個腔室
•  細胞未完全填滿腔室，細胞未均勻分佈在腔室中
•  細胞太少，無法計數。這可以通過離心細胞，以較小的體積重新懸浮並重新計數來克服
•  細胞太多而無法計數。可以使用較高的胰藍稀釋係數（例如 1:10）來克服這個問題

5.使用血球計可能很費時，而且容易受操作者主觀判斷的影響，而且某些細胞類型（例如那些形成簇的細胞）特別難以使用此方法進行計數。細胞計數設備可提供其他細胞定量方法，包括 Scepter™ Cell Counter。Muse^® 細胞分析儀可進行以流式細胞計法為基礎的細胞計數與存活率評估。Scepter™ Cell Counter 是一款便攜式手持細胞計數器，利用 Coulter 原理測量體積。它可以根據大小來量化細胞，並會從較小的碎片中分辨出較大的細胞，這與基於視覺的技術不同，後者依賴於物體識別軟體，無法可靠地檢測到小細胞。Scepter™ 細胞計數器可偵測到每個細胞，並將細胞數量顯示為細胞大小分佈直方圖。從直方圖可計算所有細胞，或使用選取功能來計算選取的子群。透過監控直方圖的變化，您可以深入瞭解從一個實驗到下一個實驗的細胞培養的健康和品質。

圖 2. 使用血球計和 trypan blue 計數細胞。可存活的細胞含有完整的細胞膜，不會吸收胰藍，在血球計上顯示為明亮/透明。死細胞的細胞膜受損，會吸收胰藍，在血球計中呈現藍色。細胞存活率可透過活細胞/死細胞的比率來估算。