Acylcarnitines 的合成與 HILIC/MS 分析

Rudolf Köhling, Markus Obkirche

Reporter US Volume 34.2

簡介

L-肉鹼於上世紀初被發現，並在脂肪酸代謝途徑中扮演重要角色。它是活化脂肪酸中的長鏈酰基跨線粒體內膜進入線粒體基質的載體，在線粒體基質中，長鏈酰基經過β-氧化反應成為乙酰CoA，通過檸檬酸循環獲得可用的能量。¹ 由此產生的「酰基-L-肉鹼」分子如 圖 1所示。由線粒體轉運缺陷引起的許多疾病都具有特定代謝功能障礙的特徵，並且取決於受影響的載體在中間代謝中的生理作用。² 因此，酰基-L-肉鹼在各種組織（如大腦、心臟和肌肉）中的功能和作用持續引起人們的濃厚興趣。

圖 1. Acyl-L-Carnitine 母體結構 R 代表不同長度的酰基鏈，這些酰基鏈來自輸送的脂肪酸。

分析要求

新生兒篩檢計畫可在嬰兒出現症狀之前檢測出可治療的疾病。液相色譜-串聯質譜法（LC/MS/MS）通過監測酰基肉鹼的水平，在嬰兒出現症狀之前檢測出可治療的疾病，大大提高了新生兒篩查計劃的篩查可能性。LC/MS/MS 一次注射即可檢測出多種疾病，這在高通量實驗室中非常重要。測量不同的酰基肉鹼可用於檢測超過 40 種不同的先天性代謝失常，其中一些選項如 表 1所示。

純淨穩定的代謝物標準物以及可靠靈敏的分析方法是在分子通路層面上研究健康和患病生物細胞功能的先決條件。因此，與臨床診斷、預後診斷和流行病學相關的人體代謝表型分析是發展精確醫學最廣泛適用的領域之一。⁷ 為了開發新的分析方法，需要建立所需代謝物的合成方法。

表 1.先天性代謝錯誤基因型-表型-關係的精選 Acyl-L-Carnitines

MIM No.*	MIM No.*
3p21.31	SLC25A20	613698	肉鹼-乙酰肉鹼轉移酶缺乏症 (CACTD)	212138
1p32.3	CPT2	600650	對急性感染性腦病的易感性 (IIAE4)	614212
2p23.3	HADHA	600890	長鏈 3-羥基乙酰-CoA脫氫酶缺乏症	609016
11q25	ACAD8	604773	異丁烯酰-CoA脫氫酶缺乏症	611283
1p31.1	ACADM	607008	中鏈 Acyl-CoA dehydrogenase Deficiency (ACADMD)	201450
8q24.3	SLC52A2	607882	Brown-Vialetto-Van Laere Syndrome 2 (BVVLS2)	614707
4q32.1	ETFDH	231675	Multiple Acyl-CoA dehydrogenase Deficiency IIC (MADD) Glutaric acidemia	231680
19p13.2	CD320	606475	經鈷胺受體缺陷所致甲基丙二酸尿症	613646
4q25	HADHSC	601609	家族性高胰島素血症	609975
11q13.3	CPT1A	600528	Carnitine Palmioyltransferase I Deficiency hepatic, type 1A	255120
10q26.13	ACADSB	600301	2-Methylbutyryl-CoA dehydrogenase Deficiency, 2-Methylbutyrylglycinuria	610006

酰基-L-肉鹼的合成

Sigma-Aldrich的酰基-L-肉鹼標準品產品組合的擴展是通過通用合成方法成功實現的。將 L-肉鹼鹽酸加入到適當的羧酸和輕微摩爾過量的氯化酸的混合物中。⁹ If the suitable acid chloride is available, the carboxylic acid was reacted in a first step with thionyl chloride and then the carnitine was adding consecutive.

為了避免在某些應用中不可取的反離子（如氯化物），所有的酰基-L-肉鹼都會在弱碱性陰離子交換器上進行後續處理，轉換成它們的內鹽。¹⁰ 原料沉澱後，需要使用柱層析來去除任何痕量的肉鹼和副產品。

酰基-L-肉鹼的LC/MS分析

由於紫外光檢測酰基肉鹼非常不靈敏，因此需要一種方法來進行分離、鑑定，並使用互補的檢測器（如質譜法 (MS) 或帶電氣溶膠檢測法 (CAD)）進行定量。MS 檢測提供所需的靈敏度，直接注入可能就足以分析一系列不同的酰基-L-肉鹼。^11,12 液相色譜-質譜法已被確立為分析酰基-L-肉鹼的有效且穩健的方法，而親水互作用液相色譜法 (HILIC) 分離游離肉鹼和酰基肉鹼的方法快速且不需要衍生化。^13-15 在本研究中，使用Ascentis^® Express OH5色譜柱，以50 mm乙酸銨中的乙腈為梯度，探索了HILIC模式色譜。LC 和 MS 儀器及設定見 表 2 和 表 3。最終色譜條件見 圖 2。

表 2.LC/MS 儀器與設定

LC 儀器	Dionex®< UltiMate® 3000 RSLC
平衡時間	10分鐘
MS 儀器	Bruker micrOTOF-Q II™
MS Scan	時間0至20，ESI(+)
氣體流量	-<<
溫度	-
乾氣	9公升/小時, 250 °C
電壓	-
毛細管 (kV)	4。5

表 3.LC-MS 分析精選的 Acyl-L-Carnitines

分析物質	摩爾數。重量	Max m/z
Stearoyl-L-Carnitine	427.66	428.371
Palmitoyl-L-Carnitine	399.61	400.3401
Myristoyl-L-Carnitine	371.4	372.3091
Lauroyl-L-Carnitine	343.5	344.2786
Decanoyl-L-Carnitine	315.45	316.2471
Octanoyl-L-Carnitine	287.4	288.2156
己酰-L-肉鹼	259.3	260.1846
異戊烯基-L-肉鹼	245.32	246.17
2-甲基丁酰-L-肉鹼	245.32	246.17
異丁酰-L-肉鹼	231.29	232.1529
丁酰-L-肉鹼	231.29	232.1529
丙酰基-L-肉鹼	217.26	218.1375
乙酰基-L-肉鹼鹽酸	203.6	204.1228
左旋肉鹼	161.2	162.1107

圖 2. 在 Ascentis Express OH5 (HILIC 模式) 上進行十二種 Acyl-L-Carnitines 的 LC/MS 分析

材料

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參考資料

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