利用 HPLC/MS/MS 測定 L-和 D-乳酸對映体

H. Henry¹, N. Marmy Conus², P. Steenhout², A. Benguin¹, O. Boulat¹

¹University of Lausanne, ²Nestac Ltd.

引言

本文總結了洛桑大學沃州中心醫院臨床化學實驗室H. Henry及其同事的工作，CH-1011 Lausanne, Switzerland¹。L-和D-乳酸對映体（圖1）的測定和隨後的定量對於嬰兒來說是非常重要的，因為如果不加以治療，D-乳酸產生的過量可能會導致代謝性酸中毒，從而引起嚴重的神經症狀。因此，D-乳酸有可能成為診斷這些疾病的臨床指標。因此，檢測乳酸，尤其是 D-乳酸水平對臨床診斷具有重要意義。目前需要一種可靠且具選擇性的方法來檢測及量化 D-乳酸。本工作展示了一種新的、高靈敏度的同時測定和定量L-和D-乳酸對映体的分析方法。該方法展示了Supelco公司的Astec CHIROBIOTIC^® R手性色譜柱在LC-MS/MS中的應用，以手性方法分離 L-和 D-乳酸對映体。此外，此方法的線性和精確度良好。

L-和D-乳酸對映体均可引起代謝性酸中毒，但由於它們的來源和代謝途徑不同，其相對貢獻是有區別的。因此，區分血漿中的乳酸異構體，對於了解它們對代謝性酸中毒症的相對貢獻非常重要。然而，由於兩種對映体具有相似的物理和化學特性，因此很難確定生物樣本中的乳酸異構體。因此，有必要開發一種靈敏可靠的方法來分離和定量尿液樣本中的乳酸對映体。目前，使用D-乳酸脫氫酶的酵素分析法可測量尿液中的D-乳酸。然而，在新生兒的尿液對照樣本中，由於D-乳酸的含量低於酶法的定量水平，因此酶法檢測缺乏靈敏度和特異性。

圖 1. L- 和 D- 乳酸的結構

目前的工作展示了一種可靠和可重複的分析方法，通過有機酸的純化和濃縮，然後手性色譜法耦合串聯質譜法，同時測定和定量尿液中的L-和D-乳酸對映体。該方法快速、簡單、有效，適用於L-乳酸和D-乳酸對映体的臨床常規檢測。本方法使用 Astec CHIROBIOTIC R 手性色譜柱，可在此處下載。使用此分析方法，L-乳酸的定量範圍為 2-400 ìm/L，D-乳酸的定量範圍為 0.5-100 µm/L，准确度高（图2）。

HPLC (Isocratic in an HPLC MS-MS system):
column:Astec CHIROBIOTIC R Chiral Column, 15 cm x 2.1 mm I．5 µm (13019AST)

移相：15% (v/v) 33.3 mM 乙酸銨於 H2O 及 85% (v/v) 乙腈

流速:0.7 mL/mi

柱溫.:4 °C

探測器：MS, ESI(-), MRM, m/z 89.1/43.3, 90.1/44.3, 93.1/46.3

圖 2. LC MS/MS 色譜圖顯示使用 Astec CHIROBIOTIC^® R 手性 HPLC 色譜柱手性分離尿液中的 L-和 D-乳酸 HPLC (Isocratic in an HPLC MS-MS system)：色譜柱：Astec CHIROBIOTIC^® R 手性色譜柱，15 cm x 2.1 mm I.D.，5 µm（產品編號 13019AST）；流動相：15% (v/v) 33.3 mM 乙酸銨於 H2O 及 85% (v/v) 乙腈；流速：0.7 mL/min; column temp：4 °C; detector：MS, ESI(-), MRM, m/z 89.1/43.3, 90.1/44.3, 93.1/46.3

結論

Astec CHIROBIOTIC^® R 手性色譜柱最適用於α-羥基/鹵化酸和 N-受阻氨基酸等親水酸類的對映分離。此相獨特的離子特性和 H-bond 能力在手性辨識機制中扮演重要角色。此外，我們還提供多種其他手性固定相，可在上述能力中使用，以解析各種分子的對映體。

參考資料

1. Henry H, Marmy Conus N, Steenhout P, Béguin A, Boulat O. 2012. ensitive determination of D-lactic acid and L-lactic acid in urine by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. [Internet]. National Library of Medicine. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21842515/