重新折疊：離子交換色譜法

就 IMAC 而言，使用離子交換層析法進行重折疊涉及變性蛋白質的可逆固定。固定化可以防止在隨後的變性劑去除過程中發生聚集。組氨酸標記蛋白在 IMAC 媒介上的吸附條件基本上是通用的，但在離子交換媒介上的吸附條件則取決於目標蛋白的電荷特性。陽離子 (如 SP Sepharose) 和陰離子交換 (如 Q Sepharose) 媒介都已成功用於重折疊。與離子交換介質結合通常需要低離子強度條件（即低於 0.1）。在低 pH 值下會促進與陽離子交換樹脂的強結合，而在高 pH 值下會促進與陰離子交換樹脂的強結合。

使用陰離子交換和陽離子交換色譜法進行重折疊的示例分別如圖 3.7 和圖 3.8 所示。實驗可以用多種方式設計。在圖 3.7 中，在不同的實驗中，將回折緩衝液注入色譜柱，並停止流動 0 至 40 小時。在圖 3.8 中，使用遞減的尿素梯度進行再折疊。

一旦重折叠，如果需要更高的纯度，并在必要时去除聚集体，可以通过凝胶过滤等其他技术进一步纯化蛋白质。

圖.3.7. 使用陰離子交換層析法重新折疊白蛋白。F1 含有重新折疊的蛋白質。經許可使用。版權所有 2005.Elsevier Science BV.

圖.3.8. 使用陽離子交換色層法重折溶菌酶。經許可使用。版權所有 2002.Elsevier Science BV.

表 3.8 列出了適用於重折疊的預包裝離子交換色譜柱。

表 3.8.適用於以離子交換層析法進行再折疊的預包裝色谱柱

柱	離子交換器類型	柱容量	動態結合容量 /mL 媒介
HiTrap Q FF	負離子交換器	>100 mg HSA
HiPrep 16/10 Q FF	20 mL<	>100 mg HSA
HiTrap Q HP	70 mg BSA
HiLoad 16/10 and 26/10 Q Sepharose HP	負離子交換	70 mg BSA
HiTrap SP FF	70毫克核糖核酸酶A
HiPrep 16/10 SP FF	70 mg 核糖核酸酶 A
HiTrap SP HP	HiLoad 16/10 和 26/10 SP Sepharose HP	55 mg 核糖核酸酶 A

重折叠分析

重折叠实验结果的综合表征可包括生物活性测定，以及同质性和二级结构的物理化学表征（通常使用圆二色性）。

在許多情況下，特別是對於功能未知的蛋白質，這個表徵程序是不可能或不實際執行的。

使用凝膠過濾的均質性檢測通常足以作為重折疊是否成功的指標。與蛋白質預期分子量相對應的對稱峰表示重折已經發生。使用預封柱 Superdex 75 5/150 GL 和 Superdex 200 5/150 GL（表 3.9）可快速進行此分析。這些色譜柱可用於重折篩選實驗後的快速分析。

表 3.9.適用於重折疊實驗後快速檢測蛋白質均勻性的預包裝色谱柱

目標蛋白 Mr	建議樣品容量	Superdex 200 5/150 GL	10 000-600 000	4-50 µL	12 min <
Superdex 75 5/150 GL	3 000-70 000 3 000-70 000	4-50 µL	12 min

材料

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