使用 TALON^® Superflow 純化組氨酸標記蛋白質

TALON^® Superflow由高度交聯的瓊脂糖珠子組成，珠子上固定有預充Co²⁺ 離子的螯合基團。

該培養基具有高選擇性地結合多組氨酸標記蛋白，並顯示出對宿主蛋白的抗性降低，與其他 IMAC 培養基相比，本底更低。該培養基與許多水性緩衝劑、變性劑以及一系列其他添加劑兼容（Appendix 1, Characteristics of Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON^® Superflow, and uncharged IMAC Sepharose products).TALON^® Superflow產品避免使用DTT（二硫蘇糖醇）、DTE（二硫赤蘚糖醇）和TCEP（TRIS (2-carboxyethyl) phosphine）。如果使用，蛋白結合能力會迅速降低。該培養基適用於批次純化，也可用於填料液相層析柱，如 Tricorn 或 XK 柱。此種培養基通常適用於以 Ni²⁺ 為基礎的 IMAC 色譜柱。

圖 3.37. TALON® Super FLOW 可在原生或變性條件下進行蛋白質純化，可與原核和真核表達系統配合使用。TALON® Super FLOW 有 10 ml 和 50 ml 兩種容量。

樣品製備

本樣品製備程序適用於所有含有 TALON^® Superflow 的格式。請參閱 Cell lysis 本章前面的一般說明。

根據結合緩衝液的成分和 pH 值調整樣品，方法包括加入緩衝液、NaCl、咪唑和濃縮儲備溶液中的添加劑；用結合緩衝液稀釋樣品；或進行緩衝液交換。

在使用樣品前，立即將樣品通過 0.22 µm 或 0.45 µm 篩檢器和/或離心。使用 HiTrap TALON^® crude 和 His GraviTrap 時，不需要過濾。如果樣本太黏稠，可以用結合緩衝液稀釋；增加裂解處理（音響處理、均質化）；或加入 DNase/RNase 減小核酸片段的大小。

結合緩衝液：	50mM磷酸鈉，300mM NaCl，pH 7.4
洗滌緩衝液：	50 mM 磷酸鈉，300 mM NaCl，5 mM咪唑，pH 7.4
洗脱緩衝液：	50 mM 磷酸鈉、300 mM NaCl、150 mM 咪唑，pH 7.4

用於製備緩衝液的水和化學品應該是高純度的。緩衝液在使用前應通過 0.45 µm 篩網過濾。

使用高純度的咪唑，它在 280 nm 下基本上沒有吸光度。

增加 NaCl 濃度至 500 mM，可以減少蛋白質因靜電相互作用而產生的非特異性結合。

清洗和洗脫所需的咪唑濃度取決於蛋白質。 Chapter 4 (Optimizing purification of histidine-tagged proteins) 以獲得更多資訊。

柱包裝

TALON^® Superflow以20%乙醇預先膨脹。

1. 裝配色譜柱（如有必要，裝配填料槽）。
2. 用水沖洗從端件和轉接頭排除空氣。確保柱床支撐下面沒有殘留的空氣。
3. 重新懸浮介質，並將漿液一次性連續倒入柱中。
4. 如果使用填料容器，請立即將柱和容器的剩餘部分注滿水。安裝填料容器的適配器或蓋子，並將色谱柱連接到泵上。
5. 打開色谱柱的底部出口，將泵設置為所需流速。
6. 打開色谱柱底部出口，設置泵以所需流速運行，此流速應至少為後續色譜程序中使用流速的 133%。

對於後續層析程序，請勿超過封裝流速的 75%。

10.  在達到恆定床面高度後，保持填料流速至少 3 個床面體積。
11.  停止泵并关闭色谱柱出口。
12. 如果使用填料储液器，断开储液器并将适配器连接到色谱柱。
13. 在适配器入口断开的情况下，将适配器向下推入色谱柱，直至到达标记处。讓填料溶液沖洗轉接器入口。
14.  將色谱柱連接到泵或色譜系統並開始平衡。如有必要，重新調整轉接器。

對於隨後的色譜程序，請勿超過填料流量的 75%。

純化
填料色譜柱的純化程序

1. 如果色譜柱中含有 20% 的乙醇，則使用 5 個床容量的蒸餾水洗滌。
2. 使用經過預處理、過濾或離心的樣品。
3. 使用洗滌緩衝液進行洗滌，直到吸光度達到基線。對於階梯洗脫，通常 8 μL 的洗脫緩衝液就足夠了。淺梯度，例如 20 試劑量的線性梯度，可以分離具有相似結合強度的蛋白質。

空白運行：
在所有正常條件下，TALON^® Superflow 的 Co²⁺ 洩漏都很低。

1. 用 5 柱体积的蒸馏水清洗色谱柱。
2. 使用 5 柱容量的洗脱缓冲液清洗色谱柱。
3. 使用 10 柱容量的结合缓冲液平衡色谱柱。