Ni Sepharose 6 Fast Flow 由 90 µM 的高度交聯琼脂糖珠子組成，其上固定了螯合配體，並隨後充入了 Ni2+ 離子。Ni Sepharose 6 Fast Flow 的配體密度可確保高結合能力，層析介質中 Ni2+ ion 的滲漏可忽略不計。Sepharose 6 Fast Flow 基質的高流速特性使其非常適合擴展，同時也適合重力流用途。此外，該培養基與組氨酸標記蛋白純化過程中常用的各種添加劑相容。附錄 1 (Charistics of Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON Superflow, and uncharged IMAC Sepharose products) 為 Ni Sepharose 6 Fast Flow 的主要特性。
圖 3.5.Ni Sepharose 6 Fast Flow 專為組氨酸標記蛋白的擴大純化而設計。
Ni Sepharose 6 Fast Flow 以 20% 乙醇預先膨脹，包裝規格為 5、25、100 和 500 mL1，以及本章稍後描述的方便預包裝形式。如需更多資訊，請聯絡您當地的代表。
色谱柱包装
请参阅随产品提供的说明，或参考 Appendix 6 (Column packing and preparation) for general guidelines for column packing.
样品制备
本样品制备程序适用于所有含有Ni Sepharose 6 Fast Flow的格式。請參閱 Cell lysis 本章前面的一般說明。
根據結合緩衝液的成分和 pH 值調整樣品，方法包括加入緩衝液、NaCl、咪唑和濃縮儲備溶液中的添加劑；用結合緩衝液稀釋樣品；或進行緩衝液交換。為了防止宿主細胞蛋白與暴露的組氨酸結合，必須在樣品和結合緩衝液中加入低濃度的咪唑（第 4 章，組氨酸標記蛋白的優化純化）。
在使用樣品前，立即將樣品通過 0.22 µM 或 0.45 µM 過濾器和/或離心。使用 HisTrap FF crude、His GraviTrap 或 His MultiTrap FF 時不需要過濾。如果樣本過於黏稠，可用結合緩衝液稀釋以防止堵塞；增加裂解處理（聲明、均質化）；或加入 DNase/RNase 以減少核酸片段的大小。
用於製備緩衝液的水和化學品應該是高純度的。緩衝液在使用前應通過 0.45 µM 的過濾器過濾。使用高純度的咪唑，因為這樣在 280 nm 處的吸光度會很低或沒有吸光度。
為了獲得最佳純度和產率，樣品和緩衝液中所需的最佳咪唑濃度因蛋白質而異。在結合緩衝液中，20 到 40 mM 的咪唑適用於許多蛋白質；在洗脫緩衝液中，500 mM 的咪唑可確保完全洗脫目標蛋白質。
作為咪唑洗脫的替代方法，可將 pH 值降低到約 4.5。(
洗脱
- 如果色谱柱含有 20% 的乙醇，用 5 柱体积的蒸馏水清洗。流速為 50 至 100 cm/h。
- 用 5 至 10 柱容量的結合緩衝液以 150 cm/h 的流速進行濕平衡。
- 使用預處理的樣品。
- 使用結合緩衝液洗滌，直到吸光度達到基線。
- 使用階梯或線性梯度洗滌緩衝液進行洗滌。
- 對於階梯洗脫，5柱容量的洗脫緩衝液通常就足夠了。
- 對於線性梯度洗脫，20柱容量以上的淺梯度可以分離具有相似結合力的蛋白質。
- 洗脱后，用 5 到 10 柱体积的结合缓冲液清洗色谱柱，使其再生。
如果要純化相同的蛋白質，則每次純化之間不需要剝離和重新充液。任何純化柱的重複使用都取決於樣品的性質，而且只能使用相同的標記蛋白，以防止交叉污染。有關這一主題以及清洗和儲存的更多資訊，請參閱 附錄 1（Ni Sepharose、Ni Sepharose excel、TALON Superflow 和不帶電的 IMAC Sepharose 產品的特性）。
手動測量吸光度時，將洗滌緩衝液用作空白。
Ni Sepharose 6 Fast Flow 可與還原劑相容。
Ni Sepharose 6 Fast Flow 可與還原劑相容，但我們建議在使用包含還原劑的緩衝液/樣品前，先去除任何弱結合的 Ni2+ 離子。要做到這一點，可以進行一次不含還原劑的空白運行（見下文）。
Ni Sepharose 6 Fast Flow 中 Ni2+ 的泄漏在所有正常条件下都很低。對於非常關鍵的應用，在上樣前進行空白處理（如下所述），可進一步減少純化過程中的滲漏。
空白運行：
- 使用結合緩衝液和洗脫緩衝液 不含 還原劑。
- 用5個柱容量的蒸餾水洗滌色谱柱（以除去20%乙醇）。
- 用5個柱容量的洗滌緩衝液洗滌。
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