引言
使用無細胞蛋白質合成試劑組合成蛋白質包括三個階段：製備轉錄模板、轉錄和翻譯。有關翻譯試劑組的使用，請參閱「翻譯」一節。
在製備轉錄模板時，有必要事先製備引物。在不同的附件中，顯示了五種不同的標記序列，通過進行兩次 PCR，可以有效地製作包含多個標記序列的轉錄模板。此外，也可以同時標記 N 端和 C 端。引物清單如下。
兩步PCR是CFPS700試劑盒方案的第一步，目的是產生DNA模板，用於下面的轉錄和翻譯。1st PCR的目的是將目標ORF序列與2nd 正向/反向引物連接起來（請見下圖）。因此，1st PCR 的正向/反向引物需要是與目標基因 ORF 的 N 端和 C 端序列重疊的目標基因特異性引物。2nd PCR中有兩組正向和反向引物。其中兩組反向 2nd PCR 引物和一組正向 2nd PCR 引物為通用引物。另一個正向 2nd PCR 引物包含一個標記序列，例如 His-、FLAG- 或 MYC-標記，因此可以根據您的標記選擇而有所不同。
在下面的詳細方案中，1st 基因特定引物和 ORF 之間的重疊長度預設為 18 bp。然而，重疊長度可延長至 30 bps，提供引物的多種選擇。1st PCR 引物集的選擇非常關鍵。如果不小心處理，會導致第 1 次 PCR 效率降低甚至失敗，隨後的第 2 次 PCR 也會失敗，最終導致蛋白質翻譯失敗。請使用引物設計工具(Primer Design Tool)(按滑鼠右鍵下載 Excel 檔案)設計第 1 次 PCR 的引物。這裡提供了如何使用此工具的說明。
圖 1. N 端 Tag 的結構
| 區域 | 位置 | 序列 5「 至 3」 | Tag |
|---|---|---|---|
| Cap | CCCGC GAAAT | ||
| S'UTR | T7 promoter | TAATA CGACT CACTA TAGGG< | |
| OMEGA序列 | CTCAC CTATC TCTCT ACACA AAACA TTTCC CTACA TACAA CTITC AACTT CCTAT T | ||
| ATG | |||
| ； | CAT CAT CAT CAT CAT | 6 X His | |
| GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG | FLAG | ||
| 標籤序列 | TAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC AGC CTG GGA GGA CCT< | HA | |
| 翻譯區域 | GGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC CAG AAG ATC GAG TGG CAC GAA | 生物素 | |
| 連結 | CTC CAG CAG GGA GGT ACT ( Leu-Gin-Gin-Gly-Gly-Thr | ||
| ORF | ATG + NNNNN NNNNN | ||
| 停止編碼子 | TAA，TAG，TGA | ||
| 3'UTR | 尾部序列 | AAAAA AAAAA GAGCT CTTGG ATCCG GCCAT AAGGT TGGAT CCGGC CATAA GGGCC TGATC CTTCG AGGGG GGGCC< |
N端TAG轉錄模板引物的製備程序
由於PCR分兩個階段進行，即第1次PCR和第2次PCR，因此需要多個引物。(圖2）。
引物清單（例如插入 His-tag）如 表 2所示。
請注意，反向引物是與 表1的序列互補的。
如果是非Tag，請保留Linker。
Linker序列可以改成適當的蛋白酶識別序列。
圖 2. N 端標籤 DNA 模板的 PCR
| 1st PCR | ||
| 引物類型/名稱引物類型/名稱 | ||
| 1st-gene-specific-NF | CCAGC AGGGA GGTAC T -+ 5' 端從 ATG 開始的 18 個 mer 陣列 | |
| 1st-gene-specific-NF | ||
| 第 1 Ry 基因特異性引物 | CCTTA TGGCC GGATO CAAGA GCTCT TIITT TITTT TA -+ 3' 端 18 mer 的陣列，不包括停止碼 | |
| 1st-gene-specific-NR | Gene specific 1st Ry primer | |
| 2nd PCR | ||
| primer type/name | primer form | 單體序列5「至3」 |
| 2nd-T7-NF2 | CCCGC GAAAT TAATA CGACT CACTA TAG | |
| 2nd-protein tag-NF1 | 2nd Fw primer-tag | CGACT CACTA TAGGG CTCAC CTATC TCTCT ACACA AAACA TITCC CTACA TACAA CTITC AACIT CCTAT TATGC ATCAT CATCA TCATC ATCTC CAGCA GGGAG GTACT ATG |
| 2nd-SU-NCR2 | GGCCC CCCCT CGAAG G | |
| 2nd-SU-NR1 | Universal 2nd Ry primer | CCCTC GAAGG ATCAG GCCCT TATGG CCGGA TCCAA |
C端TAG DNA模板的結構
C端TAG DNA模板的結構和各部分的序列如 圖3 和 表3所示。
和N-terminal標籤一樣，由於在準備好的ORF中加入了長序列，Primer的設計和PCR比一般的要複雜
。
圖 3. C 端標籤 DNA 模板
| 區域 | 地點 | 序列 S「 至 3」 | ||
|---|---|---|---|---|
| 上限 | CCCGO GAAAT | |||
| T7啟動子 | TAATA CGACT CACTA TAGGG | |||
| S'UTR | OMEGA 序列 | CTCAC CTATC TCTCT ACACA AAACA TTTCC CTACA TACAA CTTTC AACTT CCTAT T | ||
| ORF | ATG + NNNNN NNNNN | |||
| 連結器 | GGT CTC CAG CAG GGA GGT ACT (Gly-Leu-GIn-GIn-Gly-Gly-Thr<) | |||
| CAT CAT CAT CAT CAT CAT CAT | 6 x His | |||
| 轉譯區域 | GAC TAC AAG GAT GAC GAT GAC AAG | FLAG | ||
| 標籤序列 | TAT CCT TAT GAC GTG CCT GAC TAT GCC AGC CTG GGA GGA CCT< | HA | ||
| GGC CTG AAC GACGGC CTG AAC GAC ATC TTC GAG GCC CAG AAG ATC GAG TGG CAC GAA | 生物素 | |||
| 停止編碼子 | TAA、TAG、TGA | |||
| 3'UTR | 尾部序列 | AAAAA AAAAA GAGCT CITGG ATCCG GCCAT AAGGGT TGGAT CCGGC CATAA GGGCC TGATC CTTCG AGGGG GGGCC< |
C端TAG轉錄模板引物的製備步驟
由於PCR分兩個階段進行，即第1次PCR和第2次PCR，因此需要多個引物。(圖 4）。
引物清單（即 His-tag 插入）如 表 4所示。紅色的 Tag (表 3)可以改成其他 Tag 序列。
請注意 Reverse 引物與 (表 3)序列互補。
如果是非 Tag，請保留 Linker 原樣。
連結序列可以改成適當的蛋白酶辨識序列。
圖 4. C-terminal tag DNA 模板的 PCR
| 1st PCR | ||
| 引物類型/名稱 | 引物形式 | |
| 1st-gene-specific-CF | CACAA AACAT TTCCC TACAT ACAAC TTTCA ACTTC CTATT + 5' 端 18 個從 ATG 開始的 mer 陣列 | |
| 1st-gene-specific-CR | AGTAC CTCCC TGCTG GAGAC C+ a array of 18 mer at 3' end excluding stop codon | |
| 2nd PCR | ||
| primer type/name< | primer form | primer sequence 5' to 3' |
| 2nd-T7-CF | Universal 2nd Fw primer | CCCGC GAAAT TAATA CGACT CACTA TAGGG CTCAC CTATC TCTCT ACACA AAACA TTTCC< |
| 2nd-SU-NCR2 | 通用第 2 Rv 引物 | GGCCC CCCCT CGAAG G |
| 2nd-protein tag-CR1 | 2nd Rv primer-tag | CCCTC GAAGG ATCAG GCCCT TATGG CCGGA TCCAA GAGCT CTTTT TTTTT TTTAA TGATG ATGAT GATGA TGAGT ACCTC CCTGC TGG |
- 曝光時間：1/8 秒
- 應用：5 µL
- 1.5% TAE 琼脂糖凝膠
- Quick-Load 1 kb DNA Ladder (BioLabs)：5 µL
- 溴化thidium染色：30 min
由於已確認 PCR Product，若發生問題，請依下列順序再檢視一次
- 確認 PCR 程式
- 確認 PCR 原液
1st PCR
一個樣品的成分和反應程序如下表所示。
考慮到擴增效率等因素，也建議改變描述程式。
第1次PCR反應完成後，使用瓊脂糖凝膠電泳檢查第1次PCR產物（3 μL）。
在以下程序中，1st-gene-specific-F和1st-gene-specific-R表示N-端標籤轉錄模板的1st-gene-specific-NF和1st-gene-specifc-NR，而C-端標籤轉錄模板則分別表示1st-gene-specific-CF和1st-gene-specific-CR。
| 試劑 | |
|---|---|
| 10XPCR緩衝液 | 5微升 |
| 2 mM dNTPs | 5 µL |
| 25 mM MgSO4 | 3 µL< |
| 10 µM 1st-gene-specific-F | 1 µL |
| 10 µM 1st-gene-specific-R | 1 µL |
| 質粒 | 1 ng |
| KOD | 1 µL |
| 無菌水 | X µL |
| <總量 | 50 µL |
| Temp. | 時間 | 週期 |
|---|---|---|
| 94°C | 5 分鐘 | 1 |
| 98°C | 10 秒 | 30 |
| 55°C | 30 秒 | |
| 68°C | 3 min (1 min/kb) | |
| 72°C | 2 min | 1< |
| 20°C | - |
使用 PrimeSTAR 時的組成和 PCR 程式
。| 試劑 | |
|---|---|
| 5 X PrimeSTAR buffer | 10 µL |
| 2.5 mM dNTPs | 4 µL |
| 10 µM 1st-gene-specific-F | 1 µL |
| 10 µM 第一基因特異性-R | 1 µL |
| 質粒 | 1 ng |
| 聚合酶（2.5 U/µL) | 0.5 µL |
| 無菌水 | X µL |
| 總計 | 50 µL |
| Temp. | 時間 | 週期 |
|---|---|---|
| 94°C | 5 min | 1 |
| 98°C | 10 秒 | 30 |
| 55°C | 30 sec | |
| 68°C | (1分鐘/kb) | |
| 72°C | 2分鐘 | |
| 20°C | - |
使用 PrimeSTAR Max 時的組成和 PCR 程式
。| 試劑 | |
|---|---|
| 2 X PrimeSTAR Max Premix | 25 µML |
| 10 µM 1st-gene-specific-F | 1 µL |
| 10 µM 1st-gene-specific-R< | 1 µL |
| 质粒 | 1 ng |
| 无菌水 | X µL |
| 總計 | 50 µL |
| Temp. | 時間 | 週期 |
|---|---|---|
| 94°C< | 5分鐘 | 1 |
| 98°C | 10 秒 | 30 |
| 55°CC | 30 sec | |
| 68°C | (5秒./kb) | |
| 72°C | 2 min | 1 |
| 20°C | - |
2nd PCR
請使用未純化、未濃縮狀態的第 1 次 PCR 產物進行第 2 次 PCR
第 2 次 PCR 反應後，使用瓊脂糖凝膠電泳檢查第 2 次 PCR 產物（3 μL）。
此外，建議考慮擴增效率等因素更改描述程式。
*正常情況下，第 1 次 PCR 產物的 1 μL 用於第 2 次 PCR。
第 2 次 PCR 的每個程式
以下程式是 N 端標籤和 C 端標籤的通用程式。
| Temp. | 時間 | 週期 |
|---|---|---|
| 98°C | 1 min | 1 |
| 98°C | 10 sec | 10 |
| 60°C | 1 分鐘 | |
| 68°C | 3 min (1 min/kb) | |
| 98°C | 10 min (1 min/kb) | |
| 98°FC | 10秒 | 30 |
| 15 sec | ||
| 68°C | 3 min (1 min/kb)< | |
| 72°C | 2 min | 1 |
| 20°C | - |
| Temp. | 時間 | 週期 |
|---|---|---|
| 98°C< | 1分鐘 | 1 |
| 98°C | 10 秒 | 5 |
| 55°CC | 15 秒 | |
| 72°C | (5秒。/kb) | |
| 98°C | 10 sec | 30 |
| 60°C | 15秒 | |
| 72°C | (5秒./kb) | |
| 72°C | 2 min | 1 |
| 20°C | - |
第 2 次 PCR 的 N 端標籤的組成
。| Reagents | |
|---|---|
| 10 X PCR buffer | 5 µL |
| 2 mM dNTPs | 5 µL |
| 25 mM MgSO4 | 3 µL |
| 10 µLM 2nd-T7-NF2 | 1 µL |
| 100 nM 2nd-protein tag-NF1 | 1 µL< |
| 10 µM 第 2 次-SU-NCR2 | 1 µL |
| 100 nM 2nd-SU-NR1 | 1 µL |
| 1st PCR product | 1-5 µL* |
| KOD | 1 µL |
| 無菌水 | X µL |
| 總量 | 50 µL |
| 試劑 | |
|---|---|
| 5 X PrimeSTAR buffer | 10 µL |
| 2.5 mM dNTPs | 4 µL |
| 10 µM 2nd-T7-NF2 | 1 µL< |
| 100 nM 第 2 次蛋白標記-NF1 | 1 µL |
| 10 µMM 2nd-SU-NCR2 | 1 µL |
| 100 nM 2nd-SU-NR1 | 1 µL< |
| 1st PCR product | 1-5 µL* |
| 聚合酶 (2.5 U/µL) | 0.5 µL |
| 無菌水 | X µL |
| 總量 | 50 µL |
| Reagents | |
|---|---|
| 2 X PrimeSTAR Max Premix | 25 µL |
| 10 µM 2nd-T7-NF2 | 1 µL |
| 1 µL | |
| 10 µMM 2nd-SU-NCR2 | 1 µL |
| 100 nM 2nd-SU-NR1 | 1 µL |
| 1st PCR product | 1-5 µLL* |
| 無菌水 | X µL |
| 總計 | 50 µL |
第 2 次 PCR 的 C 端標籤組成
。| 試劑 | |
|---|---|
| 5 µL | |
| 2 mM dNTPs | 5 µL< |
| 25 mM MgSO4 | 3 µL |
| 10 µM 2nd-T7-CF | 1 µL |
| 100 nM 2nd-protein tag-CR1< | 1 µL |
| 10 µM 2nd-SU-NCR2 | 1 µL< |
| 第 1 個 PCR 產物 | 1-5 µL* |
| KOD | 1 µL |
| 無菌水 | X µL< |
| 總計 | 50 µL |
| 試劑 | |
|---|---|
| 5 X PrimeSTAR buffer | 10 µL |
| 2.5 mM dNTPs | 4 µL |
| 10 µM 2nd-T7-CF | 1 µL |
| 100 nM 2nd-protein tag-CR1 | 1 µL< |
| 10 µM 2nd-SU-NCR2 | 1 µL |
| 1st PCR product | 1-5 µL* |
| 聚合酶 (2.5 U/µL) | 0.5 µL |
| 無菌水 | X µL |
| 總計 | 50 µL |
| 試劑 | |
|---|---|
| 2 X PrimeSTAR Max Premix | 25 µL |
| 10 µM 2nd-T7-CF | 1 µL |
| 100 nM 2nd-protein tag-CR1 | 1 µL |
| 10 µM 2nd-SU-NCR2 | 1 µL |
| 1st PCR product | 1-5 µL* |
| 無菌水 | X µL |
| 總計 | 50 µL |
| Reagents (one reaction) | |
|---|---|
| 10 X Transcription buffer (TB) | 2.5 µL |
| 25 mM NTPs | 2.5 µL |
| 0.1 M DTT | 1.25 µL |
| T7 RNA Polymerase | 1 µL |
| 2nd PCR product | 2.5 µL |
| RNase-free water (DEPC) | 15.25 µL |
| 總計 | 25 µL |
轉錄反應
- 輕拍準備好的轉錄反應溶液，用台式離心機將附在壁上的溶液輕輕滴下。
- 蓋緊瓶蓋，防止溶液蒸發。
- 在37 °C的水浴或孵育箱中孵育3小時。
*反應時間的標準是3小時，最多6小時。
轉錄純化
- 轉錄反應完成後，將 1 μL 轉錄樣本載入瓊脂糖凝膠電泳。
- 每一份樣品（25 μL）加入 10 μL 4 M 醋酸銨，混勻後加入 100 μL 100%乙醇，倒置試管，用桌上型離心機離心幾秒鐘。在冰上靜置 20 分鐘。
乙酸銨是必要的中和試劑。請注意，當使用純化試劑、三唑、硫酸銨等進行純化時，mRNA 會失活，蛋白質無法合成。 - 在 4 °C 下，以 15,000 rpm 離心 20 分鐘
- 用移液管棄掉上清液，再用桌上型離心機離心幾秒鐘。用移液管小心吸出上清液，再次丟棄。此時，請小心不要碰觸樣品的顆粒。
- 留下顆粒直到乾燥。保持試管蓋開啟，請注意不要沾染雜質、灰塵、刷子。
＊核酸乾燥器不可使用 - 每一份樣品（25 μL轉錄反應液）加入80 μL不含RNase的水（DEPC水）溶解mRNA膠粒。
將沉澱物充分懸浮，作為 mRNA 溶液使用
* 小心，因為 mRNA 可能會黏附在管壁上，難以檢查
確認轉錄
- 確認轉錄（mRNA）
純化完成後，以電泳確認 mRNA。
- 曝光時間：1/15 秒
- 應用：1 µL
- 1.5% TAE 瓊脂質凝膠
- Quick-Load 1 kb DNA Ladder (BioLabs)：3 µL
- 溴化thidium染色：20 min
- 轉錄的濃度測量。
測量濃度時，將酚 / 氯仿系統與翻譯樣本分開純化。
轉錄反應一個目標 mRNA 的產率為 > 25 µg。
視目標蛋白而定，mRNA在轉錄反應中可能大量合成，但當mRNA大量（40 µg或以上）進行翻譯反應時，蛋白質產率反而極度下降，或無法獲得全長蛋白質。因此，我們建議您可以測量濃度，在下一章 110 μL 翻譯液的情況下，作為 mRNA 溶液。請準備並供應至 25 ~ 40 µg / 80 µL，最好是 30 ~ 35 µg / 80 µL 的 mRNA，以供每 110 µL 樣品量的翻譯之用。
在使用異源 mRNA 共表達的情況下，例如異源二聚體，共表達分子量為 A 和分子量為 B 的蛋白質，使各 mRNA 的比例分別為 A：B，mRNA 的總量約為 30 ~ 35 µg / 80 µL，以改善它們的多聚體性。
翻譯
製備翻譯反應液
用 1.5 mL 管或 PCR 管製備翻譯反應液如下。
先準備mRNA以外的試劑，使其達到室溫，然後加到mRNA溶液中，輕輕重懸，以免形成泡沫。
當mRNA濃度未知時，建議將一個轉錄反應合成的整條mRNA加入到一個翻譯反應溶液中。
| 試劑 | |
|---|---|
| 小麥胚芽萃取物 | 10 µL |
| 氨基酸混合物 | 20微升 |
| mRNA | 80微升 |
| 總 | 110 µL |
請注意，在 110 µL 溶液中加入多於 10 µL 的小麥胚芽萃取物可能會降低翻譯產品的產率。
翻譯反應（簡單批次法）
- 在 16 °C 下培養試管，讓其反應過夜（超過 10 小時）
- 用移液管輕輕混合樣品，收集在 Eppendorf 管中，在 4 ° C 下以 15,000 rpm 離心 10 分鐘。上清液儲存於 -80 ° C
Scale-Up
在本方案中，1 個翻譯反應為 110 µL，但可以擴大規模。
若要擴大規模，請增加翻譯反應系統的比例。
例如) 當110 µL的翻譯反應擴大至220 µL時，其組成為
| 小麥胚芽萃取物小麥胚芽萃取物 | 10 µL -> 20 µL |
| 氨基酸混合物 | 20 µL -> 40 µL |
| mRNA | 80 µL -> 160 µL |
如果您擴大規模，目標蛋白質的產率可能會提高。)在一個 110 µL 的翻譯反應產率為 10 µg 的情況下，一個 550 µL 的翻譯反應可以提高每個反應溶液的產率，達到目標產率，約為 70 µg
翻譯反應（透析法）
透析法可以用來代替簡單的批次法。在透析法中，將翻譯液插入透析杯內（樣品液），並使用額外的氨基酸混合物作為透析外液。透析外液的容量一般為20倍至100倍。
當使用Thermo Fisher公司生產的Slide-A-Lyzer™ Mini透析工具（樣品0.1 mL，分子量截距3.5 K）時。
- 將 2 mL 氨基酸混合物放入 24 孔滴定板的 1 孔中，用超純水稀釋 4 倍後放入，並蓋上板蓋。由於 2 mL Eppendorf 管與透析杯相匹配，因此透析方法可使用 2 mL Eppendorf 管。
- 取總容量為 110 μL 的製備好的翻轉反應液，輕輕地移到透析杯中，以免氣泡進入透析杯中，移液管的兩步推進可能會導致起泡。然後蓋上透析杯蓋。此時，請設定樣品溶液（反應層）的液面與外部透析液（氨基酸混合液）的液面處於同一水平或樣品溶 液的液面略低。
- 在 16 °C下孵育並讓其反應過夜（超過 10 小時）
此外，在 24 孔滴定板上鑽 9mm 的孔即可裝入透析杯，但如果鑽孔有困難，可使用浮子裝入微管。
蛋白質的確認
用丙烯酰胺凝膠電泳確認翻譯產品，步驟如下：
- 翻譯反應完成後，用超純水注入翻譯反應溶液至 3 μL，輕輕攪拌。
- 4℃下15,000 rpm離心20 min，收集上清液。
- 將約1-2 µL的樣品載入丙烯酰胺凝膠，然後電泳
- 根據染色方法進行檢測。
關於上述程序
程序 1.Fill up 的目的是為了保存檢測樣本，避免超載，並使未溶解的化合物溶解。如果充填到三次，可以保持反應溶液的緩衝容量，但充填超過三次時要小心。如果不需要，請跳過這一步。
程序 2.關於沉澱物，除了從小麥胚芽中提取的成分外，還可能包括未溶解的物質。如有必要，用適當的 Buffer 重懸沉澱物，以回收所需的產品。如果對從上清液中回收的目標產物量有任何疑問，這將掌握溶解率，並通過優化翻譯反應溶液進行改進。
程序 3.對於電泳樣品、Western blot、銀染色、CBB 染色，兩者的檢測量約為 1-2 µL。在免疫染色以外的檢測中，小麥胚芽成分也會被檢測到，所以不建議大量上樣。
以下是使用本試劑盒合成FLAG® 融合蛋白，並使用抗FLAG® 抗體進行Western blot檢測這些蛋白的結果。
Next Generation Cell Free Protein Expression Kit (Wheat Germ) (CFPS700) are for research use only.
KOD® and KOD-Plus-Neo are registered trademarks or trademarks of Toyobo Co、
PrimeSTAR® and PrimeSTAR® MAX are registered trademarks or trademarks of Takara Bio Inc. FLAG® 是 Sigma-Aldrich Co.LLC的註冊商標。Slide-A-Lyzer ™是Thermo Fisher Scientific Inc.的商標。
提及的其他公司名稱和產品名稱可能是各公司的其他商標和註冊商標。
試劑、產品等，不一定都有商標標示（®, ™）。
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