Duolink^® PLA 多色檢測通訊協定

本方案描述了使用 Duolink^® PLA Multicolor 試劑在單一組織或細胞樣本中同時檢測、顯示和定量多達四種蛋白質、蛋白質修飾和/或蛋白質相互作用。

材料與設備

Duolink^® PLA試劑

Duolink^® PLA試劑要執行 Duolink^® PLA Multicolor 實驗，需要下列 Duolink^® PLA Multicolor 產品：

• 兩到四個 Duolink^® PLA多色探針製作套件 （從 紅色、綠色、橙色和/或FarRed中選擇）。每個套件包括：
  • Duolink^® PLA多色寡核苷酸 兩小瓶凍乾、活化的寡核苷酸，用於與一抗結合：
    紅色寡核苷酸A 和 紅色寡核苷酸B,
    綠色寡聚體C 和 綠色寡聚體D,
    橙色寡聚體F 和 橙色寡聚體G, 
    遠紅寡核苷酸 H 和 遠紅寡核苷酸 I
  • Conjugation Buffer – For buffering the conjugation reaction
  • Stop Reagent –用於停止結合反應
  • 儲存液 - 用於保存寡聚結合抗體（PLA 探針）

  注意： 將所有試劑組 元件儲存於 -20 °C。請參閱 Duolink^® PLA Probemaker Guide for Multicolor Detection，以瞭解如何將特定的寡聚物組合至一抗。抗體結合後，將製備好的 PLA 探針儲存於 +2-8 °C。

• Duolink^® PLA多色試劑包。每個套件包括
  • 連接濃縮液 (5X) - 稀釋製成 1X 結合緩衝液
  • 連接酶 (1 U/μL) - 添加製成結合溶液
  Amplification Stock (5X) - 稀釋製成 1X Amplification Buffer
  • 聚合酶 (10 U/μL);- 加入製成 Amplification Solution。
  • 阻斷液（Blocking Solution） - 用於抗體孵育前阻斷樣品
  • Probemaker聚乳酸探針稀釋液（Probemaker PLA Probe Diluent） ；- 用於稀釋定制的 PLA 探針
  • 檢測試劑(5X) - 稀釋成 1X 檢測緩衝液

  NOTE： 1X阻斷液和1X Probemaker PLA探針稀釋液收到後可儲存於+2-8 °C。所有其他成分儲存於 -20 °C。

• 螢光清洗緩衝液
• Duolink^® ；含 DAPI 的裝片培養基 (用於玻片，儲存於 +2-8 °C)或 核染色及防褪色 (用於微孔板，儲存於 -20 °C)

附加材料

• 檢測感興趣蛋白質的一抗
• 高純度水（無菌過濾，Milli-Q^® 水或類似）
• 載片上的樣本（細胞或組織），預先進行固定、回收和透化處理

設備

熒光顯微鏡，配備適當的濾光片、相機和影像擷取軟體

37 °C 培養箱

軌道搖床

加熱濕度室或微板熱傳導塊

疏水性筆，用於劃定反應區域

冷凍塊（用於酵素）

盛載罐

镊子

移液管和吸头（从 1 μL 到 1000 μL）

与荧光显微镜兼容的盖玻片

Duolink^?® PLA 多色檢測規範

以下規範是針對玻片上 1 cm² 的樣品，需要 40 µL 的溶液才能充分覆蓋。

請根據您的反應面積和樣品數量調整用量。所有孵育都應在恆濕箱中進行。

試劑製備

洗滌緩衝液 A 和 B 應在檢測開始之前製備，方法是將一小袋的內容物溶解在高純水中，最終容量為 1,000 mL。溶液可在室溫下短期儲存（少於兩週），或在 +2-8 °C下長期儲存。

注意： 使用前將溶液調至室溫。

• 0。01X 洗滌緩衝液 B 應在檢測開始前用高純水 1:100 稀釋 1X 洗滌緩衝液 B 製備。
• 許多 Duolink^® PLA 試劑以濃縮庫存提供，使用前應立即稀釋。請勿儲存稀釋後的 Duolink^® PLA 試劑。

多色 Duolink^® PLA 規範

開始前，樣品應放置在玻璃載玻片上，並預先進行固定、回收和/或透化處理。

• 阻斷
  注意： 使用前請擰緊 1X 阻斷液的蓋子，因為滴管可能在冷凍和解凍過程中移位。儲存於 +2-8 °C。
  • 每 1 cm2 樣品加入 1 滴 (~40 µL) Duolink^® Blocking Solution。
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
• 初級抗體孵育
  注意： 加入抗體前不要讓玻片乾燥，因為這會造成背景
  • 在Probemaker PLA Probe Diluent中稀釋所有寡聚結合的一抗。
  • 從玻片上取下阻斷液。
  • 在每個樣品中加入一抗溶液。
  • 在濕度室中孵育玻片。使用適合所有一抗的最佳孵育溫度和時間。
  注意： 使用直接檢測（即寡聚結合一抗）與間接檢測（即、可能需要進行一些額外的優化。
   
• 連接
  注意： 等到加入樣品前立即加入連接酵素。
  • 拍掉玻片上的一抗溶液。
  • 室溫下用 1x Wash Buffer A 洗玻片 3x 5 分鐘。渦旋5x多色PLA結合緩衝液。
  • 將5x多色PLA結合緩衝液1:5稀釋於高純水中並混合。 對於 40 µL 的反應，在 30 µL 的高純水中加入 8 µL 的 5x 結合緩衝液（減去結合酶的容量）。為所有樣品製作足夠的溶液。
  • 使用冷凍塊（-20 °C）從冷凍庫中取出連接酵素。
  • 在 1x 結合緩衝液中以 1:20 稀釋連接酵素並混合。  對於 40 µL 結合溶液，在 38 µL 的 1x 結合緩衝液中加入 2 µL 的 Ligase。
  • 拍掉多餘的洗滌緩衝液並塗上結合溶液。
  • 在 37 °C下將玻片放在預先加熱的濕度室中培養 30 分鐘。
  注意： 另外，也可以將連接酶以 1:40 稀釋於 1x 連接緩衝液中，但反應時間需要延長至 37 °C 下 60 分鐘。
   
• 擴增
  注意： 等到加入聚合酶後，才立即加入樣品。
  • 拭去玻片上的結合液。
  • 在室溫下，用 1x 洗滌緩衝液 A 洗滌玻片 3x 5 分鐘。
  • 在洗滌過程中，製作擴大液。
  • 在高純水中以 1:5 稀釋 5x Amplification buffer 並混合。對於 40 µL 反應，在 31 µL 高純水中加入 8 µL 5x Amplification buffer（減去聚合酶的體積）。
  • 使用冷凍塊（-20 °C）將聚合酶從冷凍室取出。
  • 在 1x 擴增緩衝液中以 1:40 稀釋聚合酶並混合。
  • 拍掉多餘的洗滌緩衝液，並塗上擴增溶液。
  • 在 37 °C 下，將玻片放在預先加熱的濕度室中培養 100 分鐘。
     
• 檢測
  注意： 多色 PLA 檢測緩衝液對光線敏感。
  • 拍掉玻片上的擴增溶液。
  • 在室溫下，用 1x Wash Buffer A 洗滌玻片 3x 5 分鐘。
  • 將 5X 多色 PLA 檢測緩衝液以 1:5 的比例稀釋於高純度水中並混合。40 µL 反應，將 8 µL 5x 檢測緩衝液加入 32 µL 高純度水中。
  • 滴去多餘的洗滌緩衝液，並塗上檢測溶液。
  • 在 37 °C、預先加熱的濕度室中孵育玻片 30 分鐘。
     
• 最終清洗
  注意： 光敏試劑。保持玻片避光
  • 拍掉玻片上的檢測液
  • 室溫下用 1x Wash Buffer B 洗玻片 2x 10 分鐘
  • 用 0.01X 洗滌緩衝液 B 1 分鐘
     
• 成像準備
  注意： 含 DAPI 的 Duolink^® In Situ Mounting Media 是水性的，不會凝固。可用透明指甲油將封面貼的邊緣與玻片密封。
  • 從玻片上拭去多餘的洗滌緩衝液。
  • 使用最小量的 Duolink^® PLA Mounting Medium with DAPI，用蓋玻片鑲貼玻片。
  • 等待 15 分鐘，然後在螢光顯微鏡或共焦顯微鏡中分析，至少使用 20 倍的物鏡。

結果

影像擷取

從 Duolink^® PLA多色實驗的結果是使用熒光顯微鏡觀察的，並配備適用於所使用的檢測螢光團的濾光片。Duolink^® PLA信號在不同的細胞位置被識別為離散的螢光點（圖1A）。單個信號的大小為亞微米級，可能位於多個焦平面。因此，可能需要獲得整個樣品厚度的影像。值得注意的是，在Duolink^® PLA中使用直接檢測法（即省略寡聚結合一抗）時，不應檢測到PLA信號。如有可能，應加入生物對照（圖 1B）。

圖 1. SK-OV3 細胞受 EGF 刺激 (A) 或未受刺激作為生物對照 (B)。Duolink^® PLA 多色檢測 EGFR-HER2 相互作用（綠色）、EGFR 磷酸化（橙色）和 HER2 磷酸化（遠紅色）。細胞核經 DAPI 染色（藍色）。

基於信號強度，每種螢光顏色的擷取設定（曝光時間、增益等）可能不同。然而，重要的是，在實驗中使用相同的、優化的設定來擷取所有樣品的影像。可使用陽性和陰性對照對設定進行最佳化。如果 PLA 信號數量較多，PLA 信號可能會合併/凝聚 （圖 2）。這種情況可能發生在研究高表達蛋白質時，或在圖像捕捉過程中由於曝光過度而造成。因此，必須小心設定擷取設定和適當的一抗滴度，以獲得個別的 PLA 訊號。

圖 2. Duolink^® PLA 多色檢測未刺激的 SK-OV3 細胞中的 EGFR（綠色）、HER2（橙色）和 GAPDH（紅色）。細胞核經 DAPI 染色（藍色）。

有幾種圖像分析工具可用來量化 PLA 信號。圖像資料可分析 PLA 信號的平均螢光強度和/或每個細胞或細胞內每個區域的 PLA 信號總數（圖 3）。然後在特定實驗中報告相對於技術和/或生物對照的定量。然而，只有在 PLA 信號未凝聚且圖像像素未飽和的情況下，才能進行可靠的定量。

圖 3. 使用影像軟體進行影像分析。DAPI 染色的細胞核（藍色）會被自動偵測出來，而胞質大小則由使用者估算（綠色輪廓）。PLA 訊號（紅色）代表感興趣的蛋白質目標。在分析過程中，以白點標示的 PLA 訊號和以黃色勾勒的細胞核會被量化。

參考資料

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473

多重 PLA 紙張：

1. Leuchowius K, Clausson C, Grannas K, Erbilgin Y, Botling J, Zieba A, Landegren U, Söderberg O. 2013. Parallel Visualization of Multiple Protein Complexes in Individual Cells in Tumor Tissue. Mol Cell Proteomics. 12(6):1563-1571. https://doi.org/10.1074/mcp.o112.023374

2. Löf L, Ebai T, Dubois L, Wik L, Ronquist KG, Nolander O, Lundin E, Söderberg O, Landegren U, Kamali-Moghaddam M. 2016. Detecting individual extracellular vesicles using a multicolor in situ proximity ligation assay with flow cytometric readout. Sci Rep. 6(1): https://doi.org/10.1038/srep34358