牽引測試

下拉試驗是將蛋白質複合物吸附在珠子上，從而分離出複合物。珠子上的固定配體通過抗體標籤（如 GST、組氨酸、麥芽糖結合蛋白等）或抗體與複合體的組成部分特異性結合。Pull-down 分析常用於分離低 µg 量的複合物，主要用於鑑定單獨的亞基。它們也被用來分離材料進行有限的功能研究，但其他方法似乎更適合製造較大（毫克）量的材料。

下拉試驗是描繪蛋白質-蛋白質互作網路的重要工具。They have been successfully used on a global scale to map protein-protein interactions in a number of organisms (e.g., yeast, E. coli, C. elegans).涉及酵母兩雜交（Y2H）系統和類似技術的遺傳方法是多蛋白複合物分離的有用補充。假陽性是在全球範圍內繪製蛋白質-蛋白質互作圖譜時的一個主要問題。因此，除了相關的對照實驗之外，同時獨立進行複合物分離和 Y2H 實驗以驗證資料集是非常有用的。

本節涵蓋三種不同的拉取方法，用來分離少量的複合物，以辨識複合物的成分。其中兩種方法涉及複合物中一個（已知或假定的）成分的抗體標記。第三種方法是共免疫沉淀，使用針對一個（已知或假定）組成部分的抗體。這三種方法都是使用含有適當配體的珠子，從粗略的生物樣本中拉出複合物。表 2.1.

中概述了不同方法的利弊。

表 2.1 檢索蛋白質複合物的不同下拉試驗的優缺點

優點	屬性下拉	Tandem affinity purification (TAP)	蛋白質標籤的存在可能會影響與內源複合物競爭的結果
不需要克隆和異源表達。如果有抗體，可快速進行	非一般 - 需要取得特定的抗體

抗體下拉試驗

抗體下拉試驗是一種成熟的蛋白質複合物的分離和後續鑒定方法。GST pull-down 分析是利用 GST 標記的誘導蛋白，從生物樣本中對一種或幾種未知蛋白進行定性純化。基本原理是 GST 標記的誘餌蛋白會與其夥伴結合，產生的複合物會被固定谷胱甘肽的珠子捕獲。實驗中會加入對照，以識別在沒有誘餌蛋白的情況下與 GST 結合的假陽性結果。對照可以是表達 GST（而非誘餌融合蛋白）的單獨轉換細胞的裂解液，或是加入 GST 的非轉換細胞的裂解液。為實驗設計適當的對照是非常重要的。

一種常見的檢測形式是用離心機將珠子和結合蛋白旋轉下來，因此稱為「pull-down」。其原理如圖 2.4所示。

圖 2.4. GST pull-down 實驗大綱。右側程序顯示對照實驗。在本例中，兩個蛋白質（紫色和紅色）被 SDS-PAGE 鑒定為與誘餌蛋白質互動的夥伴（左側泳道）。另外一種蛋白質（綠色）被拉下，但被對照物質（右側通道）識別為假陽性（GST 結合物）。

GST pull-down assay using GST SpinTrap Purification Module

Materials

GST SpinTrap Purification Module containing 10× PBS: MicroSpin column.cation Module，包含 10× PBS、MicroSpin 膠柱、稀釋緩衝液和還原谷胱甘肽

緩衝液準備

1× PBS：要製備 1× PBS，請將提供的 10× PBS 用無菌水稀釋 10 倍。儲存於 4 °C。最終濃度為 10 mM 磷酸鹽，2.7 mM KCl，140 mM NaCl，pH 7.3。

稀釋緩衝液：  如供應的一樣，50 mM Tris-HCl，pH 8.0

洗脫緩衝液：  10 mM 還原型穀胱甘肽，50 mM Tris-HCl，pH 8.0。製備洗滌緩衝液時，將模組隨附的 50 mL 稀釋緩衝液全部倒入盛有還原型穀胱甘肽（0.154 g）的瓶中。搖晃至完全溶解。以 1 至 20 mL 等分的方式儲存於 -20 °C.

程序

檢測蛋白質複合物成分所需的裂解液量各不相同。一個有用的起點是相應於 106-107 個組織培養細胞的裂解液量。

1. 在每支 SpinTrap 膠柱中輕輕旋轉，將 Glutathione Sepharose 4B 沉澱。
2. 將每一柱放入乾淨的 1.5 或 2 mL 微離心管中。
3. 從每個離心管中丟棄緩衝液，並更換底部封口。
4. 向柱中加入最多 600 µL 含有 GST 融合（誘餌）蛋白的裂解液。
5. 將 600 µL 含有 GST 融合蛋白（誘導蛋白）的裂解液加到色譜柱上，作為對照，加入相同容量的 GST（無誘導蛋白）裂解液。在 4 °C 下孵育 2 小時。
6. 取下（並保存）頂蓋和底蓋。
7. 以 735 × g 離心 1 分鐘，收集流過的液體。
8. 將每支柱放入乾淨、預先標記的 1.5 或 2 mL 微離心管中。
9. 每支柱加 600 µL 1× PBS 洗滌緩衝液，重複離心程序。如果需要，可以用 1× PBS 進行額外的 600 µL 洗滌。優化此步驟以獲得良好結果非常重要。
10. 向每根色谱柱加入 100 至 200 µL 洗滌緩衝液。更換頂蓋和底蓋。室溫孵育 5 至 10 分鐘。
11. 取下並棄掉頂蓋和底蓋，將每支色谱柱放入清潔的 1.5 或 2 mL 微離心管中。
12. 離心所有色譜柱，收集洗出液。

緩衝條件的選擇可能會影響蛋白質與蛋白質之間的相互作用。

有必要優化每次實驗的洗滌條件。

複合物的回收率低，可能是因為複合物形成後，抗體標籤無法與抗體配體結合。在這種情況下，建議改變標籤位點（例如、

根據規模和所需通量，GST pull-down 分析有多種選擇（請參閱本節底部的「材料」）。

串聯抗體純化，TAP

TAP方法，無論有沒有修改，已被用來純化和鑑定來自酵母、锥虫、果實植物、人類和植物的複合物。

TAP 與先前描述的方法不同，它採用兩個連續的層析步驟來分離蛋白質複合物。使用兩個定性步驟的背後原理是為了提高純化程序的特異性，從而減少假陽性的數量。此外，本方法所使用的條件相當溫和，以保持複合物的完整性，並使產量最大化。

TAP的基本原理如圖2.5所示。簡單來說，誘餌蛋白（已知或懷疑的複合物成分）被標記上蛋白A和鈣調蛋白結合肽（CBP），兩個標記之間有煙草侵蝕病毒（TEV）蛋白酶的裂解位點。雙標記的誘餌蛋白以接近天然的水平表達，因為過度表達可能會引起非生理的相互作用。複合物首先經由蛋白 A 標籤吸附到 IgG Sepharose 膠珠上，再經 TEV 的裂解洗脫。然後將複合物吸附到鎮定劑 Sepharose 珠上（透過 CBP 標籤），再用 EGTA 洗脫。複合物成分經由 SDS-PAGE 分離，並以質譜分析。

圖 2.5. 串聯抗體純化 (TAP) 方法概述。TAP 標籤由 CBP（鈣調節素結合肽）與蛋白 A 結構域組成，並以 TEV 裂解位點分隔。此圖由 Elsevier 全球版權部門授權轉載。

在高等生物中，可能需要使用 RNAi 技術 (iTAP) 來抑制目標蛋白的相應內源基因。

共免疫沉澱

共免疫沉澱是一種成熟的技術，它使用抗體從粗糙的生物樣本中分離抗原。這個名稱是歷史性的，起源於分析方法，以抗體和抗原以正確比例混合時所得到的沉澱反應為基礎。這裡所描述的方法是一種 pull-down 分析，而不是沉澱反應。共免疫沉淀使用针对复合物中一个（已知或假定）组分的抗体。抗體與其抗原結合，而抗原是多蛋白複合物的一部分。然後透過在混合物中加入蛋白質 A 或蛋白質 G Sepharose 珠來擷取抗體-蛋白質複合物組合。其原理如圖 2.6所示。

另外，也可以將適當的抗體固定在活化的基質上，例如 NHS 活化的 Sepharose。同樣地，抗體可以交聯到蛋白A或蛋白G介質上，用於共免疫沉淀蛋白複合物的成分。

圖 2.6. 共免疫沉淀實驗大綱。

與蛋白質 A 或蛋白質 G 共免疫沉澱

材料 免疫沉澱入門套件（包含 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 和 Protein G Sepharose 4 Fast Flow）

分析緩衝液

表 2.3 哺乳動物組織培養細胞的常用裂解緩衝液

嚴格度
1% Igepal™ CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	+
Nonidet™ P-40	150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	++
RIPA	150 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 0.5% 脱氧膽酸钠 (DOC), 0.1% SDS, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.0	+++
High salt	500 mM NaCl, 1% Igepal CA-630, 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8.	++++

其他緩衝液

PBS：1 mM KH₂PO₄、10 mM Na₂HPO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、pH 7.4

清洗緩衝液：50 mM Tris，pH 8

樣品緩衝液：1% SDS、100 mM DTT、50 mM Tris、pH 7.5（還原）
 

培養基製備

n蛋白質 A Sepharose 4 Fast Flow 和蛋白質 G Sepharose 4 Fast Flow 預先在 20% 乙醇中溶解。使用前必須徹底清洗每種培養基，以去除 20% 的乙醇儲存溶液。

每個樣品需要 50 µL nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 或 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 50% 懸浮液。

1. 輕輕搖晃 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 或 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 瓶子，使培養基重悬。
2. 使用帶寬孔吸頭的移液管移除足夠的漿液，並將漿液轉移到適當的容器/試管中。小心傾倒上清液。
3. 加入 10 公升裂解緩衝液（見下文）清洗培養基。
4. 以 12 000 × g 離心 20 秒使培養基沉澱。

在步驟 2 中分配的原始培養基漿液中，每毫升加入 0.5 毫升裂解緩衝液。這樣就得到 50% 的漿液。儲存於 4 ºC 並在使用前攪拌均勻。

結合抗原

1. 將樣品（500 µL）倒入新的微離心管中。5 to 5 µL）、雜交瘤組織培養上清（5 to 100 µL）、腹水液（0.1 to 1 µL）或純化的單克隆或多克隆抗體（加入相應於1 to 5 µg的容量）。對照組應使用盡可能接近特異性抗體的非免疫抗體（例如，多克隆血清應與來自同一物種的正常血清比較）。

免疫複合物的沉澱

1. 加入 50 µL nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 或 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 懸浮液（50% 泥漿）。
2. 在 4 ºC 下輕輕混和 1 小時。
3. 以 12 000 × g 離心 20 秒，保存沉澱物 (珠子)。
4. 用 1 mL 溶劑緩衝液清洗沉澱物三次，再用清洗緩衝液清洗一次。

解離和分析

1. 在 30 µL 樣品緩衝液中懸浮最終膠團。
2. 加熱至 95 ºC，孵育 3 分鐘。
3. 以 12 000 × g 離心 20 秒，去除珠子。小心地將上清液轉移到乾淨的試管中。
4. 在上清液中加入 1 µL 0.1% 溴酚藍。
5. 用 SDS-PAGE 分析上清液，然後進行蛋白染色、胰蛋白酶消化和質譜分析。