胰蛋白酶測試程序 (EC 3.4.21.4)

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結果
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本程序以N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯（BAEE）為底物，測定胰蛋白酶活性。該程序是基於以下反應的連續分光光度速率測定（A₂₅₃, Light path = 1 cm）：

BAEE + H2O+ Trypsin

→

Nα-Benzoyl-L-arginine + ethanol

其中：
BAEE = N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯

單位定義 - 一個 BAEE 單位的胰蛋白酶活性每分鐘可產生 ΔA₂₅₃ 0.001 每分鐘，以 BAEE 為底物，pH 7.6，25 °C，反應容量為 3.20 mL。

注意事項

請參閱安全資料表，瞭解有關危害和安全處理實務的資訊。

所需試劑和設備

磷酸鈉，單鹽基 (Catalog No. S0751)

N_α-Benzoyl-L-ginine ethyl ester (BAEE, Catalog No. B4500)

1 M NaOH solution

1 M Hydrochloric acid (Catalog No. 318949)

。製備說明

使用超純水（25 ℃時電阻率≥18 MΩxcm）製備試劑。

緩衝液（67 mM 磷酸鈉緩衝液，pH 7.6，25 °C 下）- 用 8.04 mg/mL solution using sodium phosphate, monobasic (Catalog No. S0751)in ultrapure water.在 25 ℃ 下用 1 M NaOH 溶液調至 pH 7.6.

底物溶液（0.25 mM N_α-Benzoyl-L-ginine ethyl ester) - Prepare a 0.086 mg/mL溶液，使用 N_α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯 (BAEE, Catalog No. B4500)在緩衝液中。

HCl solution (1 mM Hydrochloric Acid) - 將 1,000 倍稀釋的 1 M Hydrochloric acid solution (Catalog No. 318949）於超純水中。

酵素溶液（胰蛋白酶）- 使用前，立即在冷（2-8 °C）HCl 溶液中製備含有 425-575 units/mL 胰蛋白酶的溶液。

程序

在 3.20 mL 反应混合物中，最终浓度为 62.8 mM 磷酸钠，0.23 mM N_α-Benzoyl- L- 精氨酸乙酯，0.031-0.063 mM 鹽酸、42.5-115.0 單位的胰蛋白酶。

1. 用移液管將下列試劑移入適當的石英比色皿中：

試劑	空白 (mL)	測試 (mL)
底物溶液	3.00	3.00
HCl溶液	0.200	0.125

Note: Perform Test in trilicate.

2.倒置混合並使用適當恆溫的分光光度計平衡至 25 °C。然後加入：

試劑	空白（mL）
酵素液	-	0.	測試 (mL)
酵素液	-	0.075

Note: Final volume in each cuvette must be 3.2 mL per unit definition.

3. Immediately mix by inversion and record the increase in A₂₅₃ for 5 minutes.使用 1 minute 的時間週期和最少 4 個資料點，使用 Blank 和 Tests 的最大線性速率獲得 ΔA₂₅₃/minute。

結果

計算

1.

。

其中：
df = 稀釋係數
0.001 = 根據單位定義，A₂₅₃/分鐘的變化
0.075 = 分析中使用的測試樣本的體積（mL）
注意： 由於單位定義是基於 3.2 mL，因此比色皿中的總體積不被用於計算

2.

單位/毫克固體 =
	mg solid/mL enzyme

參考資料

1. Bergmeyer H. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. 2. New York: Academic Press, Inc..