酵素化驗：葡萄糖氧化酶

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1.目的

本程序的目的是標準化葡萄糖氧化酶的酶法檢測程序。

2.範圍

本程序適用於所有對葡萄糖氧化酶活性有規範的產品。

3.定義

本程序適用於所有對葡萄糖氧化酶活性有規範的產品。定義

• 純淨水 - 來自去離子系統的水，電阻率> 或 = 18MΩ-cm 於 25 °C
• GO = 葡萄糖氧化酶
• POD = 過氧化酶
• 葡萄糖氧化酶的單位定義 = 一個單位會氧化 1.0 μMol的β-D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸內酯和H₂O₂ 在pH5.1、35 ℃時每分鐘（相當於每分鐘吸收O₂ 22.4 μL）。如果反應混合物中氧氣飽和，活性可能會增加達 100%。

4.討論

• β -D-Glucose + O2 + H₂O   ^GO ； > D-Glucono -1,5 - Lactone + H₂O₂
• H₂O₂ +o-Dianisidine(還原)   ^POD  & > o-Dianisidine（氧化）

5.責任

分析服務人員應遵循本規程的書面規定。

6.安全

請參閱安全資料表 (SDS)，瞭解危害和適當的處理預防措施。

7.程序

條件

T=35 °C, pH= 5.1, A , 光路=1 cm

方法

連續分光光度法速率測定

試劑

• 50 mM 醋酸鈉緩衝液，pH 5.1 at 35 °C (緩衝液):使用三水醋酸鈉， (產品編號 S8625)，在含氧飽和的純水中製備 500 mL (水飽和五分鐘，並在進行檢測前放置過夜)。在 35 °C 下用 1 M HCL 調整至 pH 5.1。）
• 0.21 mM o-dianisidine Solution (o-DDH): Dissolve 20 mg of o-dianisidine dihydrochloride (Product No. D9154)。或 (產品型號 F5803)用琥珀色小瓶或其他避光小瓶將 5.35 mL 用 50 mM Sodium Acetate Buffer, pH 5.1 at 35 °C (Buffer).
• 10% (w/v) β-D-(+) Glucose Substrate Solution: Prepare 60 mL in purified water using β-D-(+) Glucose.
• 0.17mMo二脒和 1.72%（w/v）葡萄糖溶液（Reaction Cocktail）：使用前，立即制备 232 mL 将 192 mL 0.21 mM o-dianisidine 溶液 (o-DDH) 與 40 mL 10% (w/v) β-D-(+) 葡萄糖底物溶液。平衡至 35 °C，必要時用 1 M HCL 調整 pH 至 5.1。
• 過氧化酶酵素溶液（POD）： 使用前，立即在冷純水中製備含 60 purpurogallin 單位/mL 的 POD Type II 溶液。
• 葡萄糖氧化酶酶液（GO）： 對於所有葡萄糖氧化酶產品（粗製品和液體產品除外），在冷緩衝液中製備 20-40 單位/毫升的初始溶液，使用前立即在冷緩衝液中稀釋至 0.4-0.8 單位/毫升（此為零時間）。將初始溶液保持在冰上。在冷緩衝液中製作新的第二稀釋液，60 分鐘後再次運行（此為 60 分鐘時間）。所有粗品和液品請參閱下表。

Crude products and liquids	第一次稀釋	第二次稀釋
G1262	0。2 mg/mL	無需再稀釋
G6766	0.2 mg/mL	無需再稀釋
G6125	2.0 mg/mL	0.1 mL+6.4 mL 緩衝液
G6641	1.0 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL 緩衝液
G9010	0.1 mL+5.0 mL 緩衝液	0.1 mL+3.0 mL 緩衝液
G2133	0.1 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL 緩衝液
G7016	0.2 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL 緩衝液
G7141	0.1 mg/mL	0.1 mL+5.0 mL Buffer
G7779 (1.0 mg/mL)	0.1 mL+0.5 mL Buffer	0.1 mL+5.0 mL 緩衝液
G7779 (0.01 mg /mL)	Neat	1.0 mL+3.0 mL 緩衝液

測試方法

將下列試劑移入適當的比色管中：

	空白
0.17 mM o-dianisidine and 1.72% (w/v) glucose solution (Reaction Cocktail)	2.9	2.9
過氧化酶溶液（POD）	0.1	0.1

然後再加入：

Glucose Oxidase Enzyme Solution (GO)	0.1	-----
50 mM 醋酸鈉緩衝液，pH 5.1 at 35 °C (Buffer)	-----	0.1

立即倒轉混合，並記錄 A_500nm/min 的增加，持續六分鐘。使用最少 1.0 分鐘的時間和最少四個 A_500nm 點，獲得測試和空白的最大線性速率。

Units/mL enzyme =	(ΔA500nm/minTest - ΔA500nm/ min Blank) * (3.1) * (df)
	(7.5) * (0.1)

3.1=化驗容量（毫升）
df=稀釋係數
7.5=氧化o-二異脒在 500 nM 時的毫摩尔消光係數
0.1=使用酵素的容量（毫升）

	單位/毫克固體=	單位/毫升酵素
		毫克固體/毫升酵素

	單位/mg蛋白質 =	單位/毫升酵素
		mg 蛋白質/毫升酵素

Final Assay Concentration

在 3.10 mL 的反應混合物中，最終濃度為 48 mM 醋酸鈉、0.16 mM o-二異烷基、1.61% (w/v) 葡萄糖和 6 個單位的過氧化物酶 (葡萄糖氧化酶的濃度會因使用的產品不同而有所差異。)

 

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