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See CR BIOT-MAJ-1013.
1. Objective
To standardize a procedure for the enzymatic assay of Carbonic Anhydrase (EC 4.2.1.1) for Wilbur-Anderson Units.
2.範圍
本程序適用於與碳酸酐酶活性相關的 Wilbur-Anderson 單位規格的所有產品。定義
3.1 純水 - 來自去離子系統的水，電阻率 > 或 = 18MΩ-cm @ 25 ºC
3.2.單位定義 - 一個 Wilbur-Anderson 單位會使 20 mM Trizma 緩衝液的 pH 值在 0 °C 下每分鐘從 8.3 降到 6.3。(一個 Wilbur-Anderson 單位基本上等於一個 Roughton-Booth 單位。)
3.3.SUB = 底物
3.4.CA = 碳酸酐酶
3.5 可比设备：
属于本操作程序定义的被替换设备范围内的设备，或根据测试样本的 FPS 中列出的适用规格已经合格的设备。如果設備至少符合下列條件之一，則該設備是合格的：
- 該設備已經合格，可以用於測試樣本，其合格證明已經記錄，並儲存在生物技術分析服務部的 「方法合格證明 」位置。
- 產品歷史證明該設備已持續使用，以準確證明測試樣本已符合規格。
- 替換設備符合製造商所設定的先前使用設備的相同規格。這台先前使用的設備已經合格，可以用於測試樣本，或者產品歷史證明該設備已經被持續使用，以準確證明測試樣本符合規格。
4.討論
碳酸酐酶催化 CO2 的可逆水合作用。這個反應涉及兩個步驟的機制。第一步是鋅結合氫氧離子對 CO2 的親核攻擊。第二步是通過電離鋅結合的水分子和移除活性位點上的一個質子來再生活性位點。
CO2 + H2O < Carbonic Anhydrase > HCO3- + H+
Zn+2-OH- + CO2 < > Zn+2 + HCO3-
Zn+2 + HO < ； > H+ + Zn+2-OH
5.責任
所有分析服務人員都有責任遵守本操作規程。安全
請參閱安全資料表 (SDS)，瞭解危害和適當的處理預防措施。Procedure
7.1 CONDITIONS: T = 0 to 3 ºC, pH = 8.3 to 6.3
7.2 METHOD: Potentiometric
7.3.設備
7.3.1 pH 計，M545 型，Corning Pinnacle 或同等產品
7.3.2 Orion 8203BN "PerPHect ", "ROSS GLASS"，帶 BNC 連接器的半微型電極，Thermo Electron Corporation 或同類電極
7.3.3 Digital Stir plate or equivalent
7.3.4 Spinbar, Stirring Bar,Teflon, Flea Micro, 10 x 3 mm, Aldrich Z283878-3 或同等產品
7.3.5 Air displacement pipetters and appropriate plastic tips
7.3.6 Digital thermometer, calibrated
7.3.7 帶聚乙烯扣蓋的四個 Dram 小瓶。
7.3.8 Digital, NIST Traceable Timer, increments in hundredth of a second or equivalent
7.4.REAGENTS
7.4.1 Buffer, reference standard, pH 7.00 +/- 0.01 at 25 oC, Product Number B4770, Buffer, reference standard, pH 4.00 +/- 0.01，25 °C， 產品編號 B5020，以及緩衝液，參考標準，pH 10.00 +/-0.01，25 °C， 產品編號 B4895。使用 「原樣」（"Neat"）（pH REF）
7.4.2 20 mM Trizma Base Buffer, pH 8.3 at 25 oC (BUFFER )
7.4.2.1 Prepare at 2.43 mg / mL in purified water using Trizma Base, Reagent Grade, Product Number T1503.
7.4.2.2 在 25 °C 下用 2 N 硫酸調整 pH 至 8.3。儲存於 1 L 聚丙烯瓶中，並用冰蓋蓋至瓶蓋底部。
7.4.3 CO2 水溶液（SUB）
原液（Neat）使用 "Vess Seltzer, No Sodium Water"。儲存於冰至蓋子底部。
7.4.4 乾冰。
7.4.4.1 可從包裝中獲得。
7.4.5 碳酸酐酶酶液（CA）
7．1 在移液到反應混合物中之前，立即用含有 2.0 mg 固體 / mL 的冷純水配制溶液。然後立即稀釋至 60 至 90 單位 / mL。
7.4.5.2 這個濃度相應於 10 至 20 秒的反應時間。4.5.3 Prepare a fresh sample/control weigh-up and dilution for each run.
7.4.5.4 Prepare Test in duplicate.
7.5酵素分析法
7.5.1 在冷藏室底部放置至少40個4dram小瓶。
7.5.2 Place a large suitable container of ice on top of the digital stirrer along with a small four dram rack.將約 10 mL 的各 pH 參考緩衝液試劑 7.4.1 (pH REF)放入 7.5.1 中預先冷凍的四dram 小瓶中。讓各 pH 參比緩衝液和 pH 電極平衡至低於 3 °C。使用數位溫度計檢查各參考緩衝液的溫度。同時，將 pH 計預設為最高 3 °C。使用各 pH 參考緩衝液校準 pH 計。
7.5.3 Performing Blank Reaction
7.5.3.1 Immediately prior to performing the assay on the blank, pipette (in milliliters) the following reagents into a pre-chilled four dram vial with a micro stir bar.
7.5.3.2 用數字溫度計查看反應混合物的溫度。如果低於 3 oC，則進行步驟 7.5.3.3，如果不低於 3 oC，則可以使用乾冰加速冷卻，但要注意不要凍結溶液。然後將 pH 電極放入溶液中，以約 300 rpm 的速度攪拌
7.5.3.3 pH 值達到最大 pH 值 (> 8.5) 之後，以反向移液方式加入下列物質：
7.5.3.4 記錄 pH 從 8.3 變到 6.3 所需的時間 (T-空白)。每次加入反應物後，確保 Reagent 7.4.3 (SUB)關閉。
7.5.3.5 第一次打開 Reagent 7.4.3 (SUB)後的一般空白時間約為 40 秒。將此時間記錄為 "Blank-1"。如果出現這種情況，請將試劑 7.4.3 (SUB)在 1 L 燒杯和 "Vess Seltzer "瓶之間倒轉幾次。將試劑 7.4.3 (SUB)放回冰中。重複步驟 7.5.3.1 至步驟 7.5.3.4。以秒為單位記錄所有空白時間。每次打開含有試劑 7.4.(SUB)的瓶子，空白時間都會增加。一旦空白時間達到 65 秒，繼續 7.5.4。
7.5.3.6 即使第一次空白時間在 70 到 100 秒之間，pH 值從 7.0 降到 6.3 的秒數也必須少於 8 秒。由於 Trizma 的 pKa 為 8.1，因此反應混合物的緩衝能力已降低。進行三次空白測試後，如果 pH 值從 7.0 降至 6.3 所需的平均時間大於 8 秒，則更換試劑 7.4.3 (SUB)，並製備新的試劑 7.4.2 (緩衝液).
7.5.4 進行測試-控制反應
7．1 Immediately following performing of the assay on the blank, pipette (in milliliters) the following reagents into a pre-chilled four dram vial with a micro stir bar.
7.5.4.2 用數字溫度計查看反應混合物的溫度。如果低於 3 oC，則進行本步驟 7.5.4.3，如果不低於 3 oC，則可以使用乾冰加速冷卻，注意不要凍結溶液。
7.5.4.3 pH 達到最大 pH 值（> 8.5）後，反向移液加入下列液體：
7.5.4.4 當 pH 值達到 8.4 至 8.5 時，加入下列內容：
7.5.4.5 記錄 pH 值從 8.3 變到 6.3 所需的時間（T-Test），單位為秒。
7.5.4.6 重複步驟 7.5.3，評估試劑 7.4.3 (SUB)。如果空白值在 70 至 100 秒的範圍內，繼續進行樣品測試步驟 7.5.5。如果過高，在試劑 7.4.3 (SUB)中加入小片乾冰，然後倒置。在冰上平衡五分鐘。重複步驟 7.5.3，直到空白時間在 70 到 100 秒之間。回想一下，每次打開試劑底物瓶，空白時間都會增加。
7.5.5 Performing Test-Sample-1 Reaction
7.5.5.1 Immediately prior to performing the assay on the blank, pipette (in milliliters) the following reagents into a pre-chilled four dram vial with a micro stir bar.
7.5.5.2 用數字溫度計查看反應混合物的溫度。如果低於 3 oC，則進行本步驟 7.5.4.3，如果不低於 3 oC，則可使用乾冰加速冷卻，注意不要使溶液凍結。然後將 pH 電極放入溶液中，以約 300 rpm 的速度攪拌：加入乾冰後，請勿將蓋子蓋得太緊！
7.5.5.3 pH 值達到最大 pH 值（8.5）後，反向移液加入下列物質：
7.5.5.4 當 pH 值達到 8.4 至 8.5 時，加入下列內容：
7.5.5.5 記錄 pH 從 8.3 變到 6.3 所需的時間（T-Test），單位為秒。
7.5.5.6 評估試劑 7.4.3 (SUB)，重複步驟 7.5.3。如果Blank在70到100秒的範圍內，繼續進行樣品測試步驟7.5.6。如果過高，在試劑 7.4.3 (SUB)中加入小塊乾冰，然後倒置。在冰上平衡五分鐘。重複步驟 7.5.3，直到空白時間在 65 至 85 秒之間。回想一下，每次打開試劑底物瓶，空白時間都會增加。
7.5.6. Performing Test-Sample-2 Reaction
7.5.6.1 Repeat steps 7.5.5.1 to 7.5.5.6 for Test-Sample-2
7.5.6.2 At this time in the procedure, there should be a minimum of five Blank values with a blank average time in the range of 70 to 100 seconds..此外，一個對照應有一個 10 至 20 秒的值，每個樣品測試應有一個 10 至 20 秒的值。
7.6 計算
7.6.1 Calculate the average, standard deviation, and % Coefficient of Variation for all recorded blanks in the range of 70 seconds to 100 seconds.
% CV = Standard Deviation X 100 /Average
The % CV must be ≤20%; if not, the control must be within 70% of release value.
7.6.2 按以下方法測定碳酸酐酶單位/毫升：
7.6.2 按以下方法測定碳酸酐酶單位/毫升：
where,
T = Time (in seconds) required for pH to change from 8.3 to 6.3 as per Unit Definition
df = dilution factor of Reagent 7.4.5 (CA) used
0.05 = Volume (in milliliters) of Reagent 7.4.5 (CA) used
7.6.3 Determine the Carbonic Anhydrase Units / mg solid as follows:
7.
7.6.4 確定碳酸酐酶單位/毫克蛋白如下：
8.批准
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