寡核苷酸處理與穩定性

• 暫停、儲存和工作習慣
準備解決方案
• 長式重懸浮計算範例
• 結論

DNA 寡核苷酸是相對穩定的分子（表 1）。

表 1. 非改性、單鏈 DNA 寡核苷酸在適當儲存下的近似保存期限。這些值為估計值，並非保證。

條件	期限
無論是乾燥或溶液（水或 TE 緩衝液），都可穩定約 2 年
無論是乾燥或溶液（水或 TE 緩衝液），都可穩定約 1 年 <
熱天 (非溫控運送或 倉庫儲存)	無論是乾燥或在 TE 緩衝中，都可穩定約 1 - 2 個月

重懸浮、儲存和工作習慣

未修飾的 DNA

重懸浮。 除非要求以溶液形式發貨，否則所有單鏈 DNA 寡核苷酸在發貨時都是乾的，重新懸浮後即可使用，但硫醇修飾的序列除外（請遵循以下步驟 ）。nbsp;還原協議 以活化這些寡核苷酸）。弱緩衝液，如 TE（10 mM Tris，pH 7.5 至 8.0，1 mM EDTA）或 Tris（10 mM Tris-HCl，pH 8.0），以 TE 為最佳選擇。

儲存. 如表 1 所示，儲存於 -20 °C 可提供最長的保存期限。TE 緩衝液是絕對的最佳選擇，因為實驗室等級的水通常呈微酸性，會使 DNA 慢慢降解。此外，乾燥的寡聚體永遠不會真正乾燥。總會殘留一些水分，進而導致緩慢降解。

非改性 RNA

懸浮。 單鏈 RNA 寡核苷酸應按照上述非修飾 DNA 的方法重懸。

儲存。 由於其化學結構，RNA 比 DNA 更不穩定。RNA會自動催化（圖1），也會被RNase降解，RNase在實驗室中比比皆是，因為它們存在於脫落的皮膚細胞和無處不在的微生物中。

圖 1.RNA 自催化。 RNA 的 2'- 羥基可導致自催化降解，而在適當的條件下，又會降低有用寡核苷酸的數量。

短期儲存時，單鏈 RNA 寡核苷酸應儲存在 -80 °C 的 TE 緩衝液中。對於長期保存，最佳的選擇是以乙醇沉澱物的形式保存在 -80 °C。

使用 RNA 工作。 RNase 通常含有大量二硫鍵，因此非常穩定。除非使用刺激性化學品來消除這些酵素，否則它們對常見的淨化方法（例如高壓消毒）有抵抗力。以下預防措施將有助於減少您的 RNA 寡核苷酸與 RNase 的接觸：

• 假設您工作區域/實驗室中的所有東西都受到 RNase 的污染。
• 使用實驗室的隔離部分，專門用來處理 RNA。
• 使用能破壞 RNase 的物質例行清潔 RNA 隔離區。
• 使用經認證不含 RNase 的化學品、試劑和水。
• 使用僅用於處理 RNA 的工具，例如微量移液管。
• 經常戴手套，並在接觸其他表面後更換手套。

改性寡核苷酸

懸浮。 修飾過的寡核苷酸，不論是 DNA 或 RNA，都應該重懸在 TE 緩衝液中。

儲存。 經修飾的寡核苷酸應具有與未修飾的 DNA 和 RNA 相似的穩定性。因此，應根據上述有關 DNA 和 RNA 的建議進行儲存。

使用螢光修飾時。使用螢光分子時，為了防止光漂白，請將它們保存在琥珀色試管中，如果轉移到透明試管中，則用鋁箔包住。

雙工寡核苷酸

我們的科學家發現 siRNA 雙工物在 -20 °C 乾燥保存時至少可以穩定 3 年。DNA duplexes 應該也一樣穩定，甚至更穩定（此數值為估計值，並非保證。若要獲得由實驗決定的有效期限與保證，請向我們洽詢穩定性研究 [如下]）。

單次使用等分液體

有許多濃度單位，但微摩爾 (µM) 可能是寡核苷酸最常用的單位。在此，我們將以試管標籤/技術資料表上已確定的 nmol 數量為例，提供製作 100 µM 儲備溶液和 10 µM 工作溶液所需的長式和捷徑計算。如需更快速的結果，包括以其他單位計算濃度，請使用 OligoEvaluator™的重懸浮和稀釋模組。

長式重懸液計算範例

我們偏好使用基本單位，以協助防止尺寸分析過程中的「轉換混淆」。當直接嘗試在 nmol、µM 和其他次基本單位之間進行轉換時，很容易犯錯。

步驟 1。將試管標籤/技術資料表上的 nmol 數量轉換為摩爾數。

我們假設的寡核苷酸到達時的數量為 49.9 nmol.

mol = 49.9 nmol x 1 mol 109 nmol^-1

mol = 4.99 x 10^-8
 

mol = 4.

步驟 2.將所需的儲備溶液濃度 100 µM 轉換為摩爾濃度。

100 µM = 100 µmol L^-1

M (mol L^-1) = 100 µmol L^-1 x 1 mol 106 mol^-1

M (mol L^-1) = 1 x 10^-4
 

。

步驟 3。使用所需的湯液濃度（摩爾數）和摩爾數計算重懸所需的容積（升）。

1 x 10^-4 mol L-1 = 4.99 x 10^-8mol

L = 4.99 x 10^-8mol / 1 x 10^-4mol

L = 4.99 x 10^-4
 

步驟 4.將升轉換為微升 (µL).

Volume = 4.99 x 10^-4 L x 10⁶ µL L^-1

Volume = 4.99 µL
 

示例捷徑重懸計算

步驟 1.從試管標籤 / 技術資料表取得 nmol 數量，再乘以 10，得到以微升為單位的重懸浮容量。

Volume = 4.99 nmol x 10

Volume = 499 µL

此捷徑計算僅適用於建立 100 µM 溶液。

在這種特殊情況下，向含有寡核苷酸的試管中加入 499 µL 的水或緩衝液，然後旋轉以確保充分混合。

關於重悬的其他想法

上述重悬示例使用 100 µM，因為這是典型的實驗室儲備溶液濃度。製作濃度遠低於 100 µM 的儲備溶液可能會有問題，因為重懸所需的體積很容易超過試管的 2 mL 容量。

同樣地，嘗試製作濃度高於 100 µM 的儲備溶液也會產生問題。例如，若要製作 1000 µM 的儲備溶液，此特定寡核苷酸需要 49.9 µL 的水或緩衝液。

要製作 100 µM 的儲備溶液，實際上不需要計算和線上工具，因為重懸所需的體積已包含在技術資料表中。

工作溶液計算範例

在本例中，我們假設最終的 10 µM 工作溶液的容量為 20 µL，這是 PCR 的典型值。

步驟 1。使用此濃度、容量等效公式。

C₁V₁ = C₂V₂

100 µM x V₁ = 10 µML

V₁ = 2 µL

我們非常謹慎地確保我們的 OD 值是準確的。 但是，您可能還是想要驗證寡核苷酸的數量。在這種情況下，如果您有傳統的 UV/Vis 分光光度計，方法很簡單。

請遵循以下步驟：

1. 將寡核苷酸重悬於 400 µL 水或緩衝液中。
2. 將 12 µL 稀釋到 988 µL 無菌、不含核酸的水中。
3. 在比色池中對 1 mL 樣品進行 A₂₆₀ 讀數。
4. 確保 OD 值在線性範圍內（~0.1 至 1 OD）。
5. 將樣品容量的 OD 值乘以稀釋係數。
   Total OD = OD of 1 mL sample X 400/12
6. 將總 OD 乘以 µg/OD（來自技術數據表），得到 µg。

結論

即使處理不善，如果在交貨後不久即使用，大多數單鏈 DNA 寡核苷酸都能穩定地發揮良好功能。如果需要其他協助，請洽詢我們的技術服務團隊，網址為 [email protected]。

參考資料

1. Roder B, Fruhwirth K, Vogl C, Wagner M, Rossmanith P. 2010. Impact of Long-Term Storage on Stability of Standard DNA for Nucleic Acid-Based Methods. Journal of Clinical Microbiology. 48(11):4260-4262. https://doi.org/10.1128/jcm.01230-10